背景及概述[1]
β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸又叫β-煙酰胺單核苷酸(NMN)，是輔酶I的合成底物，同時NMN也被用于抗衰老研究。日本慶應(yīng)義塾大學(xué)和美國華盛頓大學(xué)合作，正在對β-NMN的抗衰老效果和安全性進行人體臨床試驗。研究表明，β-NMN對胰島素的分泌也能起到調(diào)節(jié)作用，對mRNA的表達水平也有影響，β-NMN在醫(yī)療治療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
制備[1-2]
報道一、
β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸的合成工藝路線圖如下：
a、縮合(即制備煙酸乙酯三乙酰核苷)：
1L三口瓶中加入四乙酰核糖(20g，62.8mmol)，20mL二氯甲烷，攪拌溶解，再加入煙酸乙酯(14.3g，94.3mmol)，攪拌均勻；室溫下，滴加用20mL二氯甲烷稀釋的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf 21g，94.3mmol)，滴加過程放熱，控制溫度在40℃以下，約0.5小時內(nèi)加完，滴加完畢，接著攪拌反應(yīng)0.5～1小時以完成反應(yīng)(TLC監(jiān)控四乙酰核糖消失)。反應(yīng)完成，反應(yīng)液冷卻至-5℃以下，滴加10mL乙醇，加完攪拌15min以破壞TMSOTf淬滅反應(yīng)，從而終止反應(yīng)。由此制得含有煙酸乙酯三乙酰核苷的溶液，該溶液無需后處理直接用于下一步。
b、脫乙酰基(制備煙酸乙酯核苷)：
-5℃，向步驟a制得的含有煙酸乙酯三乙酰核苷的溶液中滴加乙醇鈉溶液(由17.1g，251mmol乙醇鈉溶于160mL乙醇制得)，滴加過程放熱，控制溫度在0℃以下，約0.5小時加完，滴加完畢，-5℃攪拌反應(yīng)1小時以完成反應(yīng)(TLC監(jiān)控至原料和中間體1消失)。反應(yīng)完成，滴加醋酸(15.1g，251mmol)酸化至pH為5～6，以除掉過量乙醇鈉，從而淬滅反應(yīng)。然后慢慢加入1400mL甲基叔丁基醚，-5～5℃攪拌析晶0.5小時，過濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗滌，室溫減壓干燥，得到37.8g煙酸乙酯核苷的三氟甲磺酸鹽(含醋酸鈉)，無需除去醋酸鈉，直接用于下一步。前兩步收率加和的總收率約80％，核磁無明顯有機雜質(zhì)。
c、磷酸化(即制備5’-煙酸乙酯單核苷酸)：
稱取4g步驟b所得煙酸乙酯核苷的三氟甲磺酸鹽(含醋酸鈉)，加至250mL三口瓶，冷卻至-5℃以下，慢慢加入8mL磷酸三甲酯，滴加16mL三氯氧磷，滴加過程放熱，控制溫度在5℃以下，約30分鐘加完。接著在-10～-5℃攪拌反應(yīng)過夜(16小時，Lc-Ms監(jiān)控)。次日，向反應(yīng)液中慢慢加入140mL甲基叔丁基醚，-5～5℃攪拌15min，靜置5min，除去甲基叔丁基醚層，再次加入20mL甲基叔丁基醚，-5～5℃攪拌5min，靜置5min，除去甲基叔丁基醚層，得到糖狀固體，即5’-煙酸乙酯單核苷酸。加入10mL乙腈攪拌均勻，然后滴加用10mL乙腈稀釋的1mL水，滴加過程放熱，控制溫度在5℃以下，中間態(tài)磷酰氯水解為磷酸基，加完即得含有5’-煙酸乙酯單核苷酸的乙腈溶液，將該乙腈溶液冷卻至-5℃以下備用，無需純化直接用于下一步。
d、氨解(即制備β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸)：
-5℃，向步驟c所得含有5’-煙酸乙酯單核苷酸的乙腈溶液中通氨氣反應(yīng)，反應(yīng)放熱，控制反應(yīng)溫度在5℃以下，通氨氣約30分鐘，然后-5℃攪拌反應(yīng)30min(Lc-Ms監(jiān)控)，析出大量糖狀物，去掉乙腈層，然后加入含2mL水的20mL乙腈，-5℃攪拌15min，再次去掉乙腈層，再次加入20mL乙腈，-5℃攪拌15min，去掉乙腈層，即得到Lc-Ms純度在97％的β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸的銨鹽。
用弱堿性陰離子交換樹脂除去無機鹽氯化銨等，酸化除去過量氨氣，即得到HPLC純度在97％以上的β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸水溶液，凍干得到2.8gβ-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸。
報道二、
在500ml的四口瓶中加入150ml的磷酸鹽緩沖溶液。
一次性加入2g氯化鎂、10g ATP、7g核糖、10g煙酰胺，在35℃保溫攪拌。
檢測反應(yīng)體系的pH值，并用10％Na2CO3溶液調(diào)pH＝8.0，再加入1gRK酶粉、2gNAMPT酶粉，攪拌溶解。
于37℃下，200rpm攪拌反應(yīng)，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)過6小時反應(yīng)后，檢測ATP已經(jīng)消耗完畢，停止反應(yīng)。通過進一步的過濾，HZ-818型大孔樹脂吸附，凍干，乙醇和水重結(jié)晶即可獲得β-煙酰胺單核苷酸-煙酰胺單核苷酸NMN，收率70％。
參考文獻
[1] [中國發(fā)明] CN201810835636.6 制備β-煙酰胺單核苷酸或β-煙酰胺核糖的方法
[2] [中國發(fā)明] CN201910511136.1 煙酰胺單核苷酸及其制備方法