前言

麥角硫因(ergothioneine,EGT)又名為2-硫基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是存在于很多動植物體內(nèi)含量豐富的天然氨基酸，僅在部分微生物(放線菌、鏈霉菌)、蕈菌、某些藍細菌中合成，不能由動物機體自身合成EGT，人體只能從食物中攝入并通過高特異性的有機陽離子轉運蛋白1型(organic cation transpoter novel type-1,OCTN1)在各種細胞和組織中積累高濃度EGT。EGT被認為是一種很強的抗氧化劑，Servillo等對其抗氧化機理進行了探討，認為其擁有獨特的氧化還原機制，并提出了一種EGT在細胞中的獨特抗氧化作用。EGT的標準氧化還原電位是-0.06V，其它硫醇的電勢一般在-0.32V～-0.2V之間，因此EGT在生理pH環(huán)境下比其他抗氧化劑更穩(wěn)定，不易自發(fā)氧化。研究表明，EGT具有多種重要的生理功能，如抗炎作用；通過保護DNA實現(xiàn)的細胞保護功能；通過促進神經(jīng)細胞分化作用促進神經(jīng)新生達到的抗抑郁功能；通過抵抗氧化應激實現(xiàn)的眼睛保護功能；通過中斷與動脈粥樣硬化發(fā)生相關的黏附分子表達實現(xiàn)的心腦血管保護功能；通過抑制毒性達到的對神經(jīng)退行性疾病的預防和治療作用等，且本身具有安全性，因此，EGT在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應用前景。

EGT生產(chǎn)方式有化學合成、食用菌提取及微生物發(fā)酵等，由于前兩者成本較高，工序復雜，因此食用菌菌絲的深層發(fā)酵是目前EGT工業(yè)化生產(chǎn)的主流模式，但自然菌株EGT產(chǎn)量低，需要通過育種技術培育EGT高產(chǎn)工業(yè)化菌種，培育工業(yè)食用菌菌種的方法有誘變育種、雜交育種、基因工程育種及原生質體融合育種等，但每種育種方法都需要進行多次、大樣本量EGT含量檢測，需說明的是，育種過程中EGT含量檢測的意義更多在于比較樣本間含量高低。目前EGT的檢測方法有高效液相色譜法、高效毛細管電泳法和薄層電泳法等。使用最為廣泛的是高效液相色譜法，該方法可以從物質復雜的體系中準確檢測出EGT的含量，但高效液相色譜法有其明顯缺陷，即需探索針對不同樣品不同的檢測條件，且由于EGT出峰時間晚，標品昂貴，在育種需從大量樣本中篩選出高產(chǎn)樣本的情況下會導致檢測耗時過長，成本過高，極大地阻礙了EGT的開發(fā)與應用研究，因此，急需建立一 種可準確測定樣本間EGT濃度的高通量快速檢測方法。

由于EGT具有強抗氧化性，2價鐵離子還原性適中(既不會受空氣中氧氣接觸干擾，也不會因為還原性太弱導致指示性降低)，EGT能與2價鐵離子反應生成無色螯合物，同時硫氰酸根離子與二價鐵離子反應生成紅色絡合物，根據(jù)以上特點，本研究選用硫氰酸鐵為還原劑，使用麥角硫因標準品與硫氰酸鐵反應，旨在建立一種麥角硫因的高通量檢測體系。同時以不同靈芝菌株EGT產(chǎn)量不同對該高通量檢測體系進行驗證。本研究結果將為高產(chǎn)EGT微生物的篩選及高產(chǎn)EGT新菌株的選育提供了新的方法和思路。

代表性結果

討論與結論

根據(jù)麥角硫因具有強還原性的理化性質，在構建出EGT-硫氰酸鐵體系之前，還先后實驗構建堿性高錳酸鉀體系、溴甲酚綠體系、藍瓶子亞甲基藍體系、愈創(chuàng)木酚體系、氯化鐵-EGT體系，結果表明：堿性高錳酸鉀體系因為穩(wěn)定性低失?。讳寮追泳G體系顯色結果因為與pH有關失?。凰{瓶子亞甲基藍體系中，由于還原態(tài)亞甲基藍的還原性太強，與空氣中的氧氣接觸也極易被氧化成亞甲基藍，導致實驗無現(xiàn)象而失?。挥鷦?chuàng)木酚體系同樣因為還原性太強受氧氣接觸干擾而失??；氯化鐵體系因為顯色程度太低而失敗。EGT-硫氰酸鐵體系可以用于EGT高通量檢測方法的研究。

EGT-硫氰酸鐵檢測體系構建過程中發(fā)現(xiàn)，待測樣品按照普通EGT粗提方法即醇沉-氮吹-定容提取時，提取液中殘留的酚類物質會影響體系的顯色反應，降低體系的靈敏度，因此粗提液在氮吹定容后，需增加氯仿除酚步驟。

靈芝是我國傳統(tǒng)名貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質和生理功能，其麥角硫因含量在眾多食用菌中含量較高，但是作為商業(yè)化生產(chǎn)的菌株其產(chǎn)量還偏低，因此培育高產(chǎn)麥角硫因的靈芝新菌株具有重要的意義及實際應用價值，基于以上原因，本實驗室通過原生質體融合再生，分離鑒定得到一批擬融合子，本方法驗證過程使用的靈芝融合子，均來源于此。

本研究建立的方法基于EGT本身理化性質，檢測體系靈敏穩(wěn)定，適用于產(chǎn)EGT工業(yè)發(fā)酵菌株選育過程中，大批量樣本的快速比較，且理論上只需經(jīng)過簡單的樣品EGT提取優(yōu)化，即可適用于絕大部分菌株EGT含量的高通量快速檢測，打破了原有EGT研究檢測的局限性，為EGT的整體開發(fā)應用研究提供了新的方法和思路。該研究成果發(fā)表在《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2022年第1期，歡迎引用(點擊左下方“閱讀原文”可查看全文)。

引用格式：

徐晴元,游俊健,林俊芳,等.靈芝麥角硫因高通量檢測方法研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2022,34:114-120. Xu QY,You JJ,Lin JF,et al.A high-throughput detection method of ergothione in Ganoderma spp.[J].Nat Prod Res Dev,2022,34:114-120.