背景技術(shù)

無花果系桑科無花果屬植物（FicusCaricaL)，無花果的果實(shí)中含有多種人體所需的氨基酸，并且含有豐富的VA和VC等多種維生素，不僅口味甘美，而且具有極大的藥用價(jià)值。在中醫(yī)上，無花果主要用于"健胃清腸，消腫解毒"以及治療腸炎、痢疾、痔瘡等。無花果葉除可以治療痔瘡、腫毒、心痛外，還具有一定的抗高血壓和抗癌作用。無花果葉提取物具有極強(qiáng)的抑菌活性，可作為天然防腐劑用于食品中。補(bǔ)骨脂素和佛手內(nèi)酯是無花果葉提取物中的主要抑菌成分。補(bǔ)骨脂素還可引起光過敏，注射或內(nèi)服此等物質(zhì)，再以長波紫外線或日光照射，可使受照射處之皮膚紅腫、色素增加，甚至表皮增厚；還可用來治療白癜風(fēng)。

高速逆流色譜技術(shù)（High-SpeedCountercurrentChromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，其原理是利用螺旋柱在行星式的運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí)保留其中的一相（固定相），利用恒流泵連續(xù)輸入另一相（流動(dòng)相），隨流動(dòng)相進(jìn)入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。在流動(dòng)相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脫。傳統(tǒng)的液相色譜技術(shù)進(jìn)行制備量分離時(shí)，分配效率低，溶劑消耗量大，而且固態(tài)支持體或載體會(huì)帶來樣品被吸附、損耗和變性等問題；而HSCCC能保證較高峰型分辨率，具有操作簡便，分離量大，樣品無損耗，分離效率高，理論回收率為100%，重現(xiàn)性好和分離環(huán)境緩和等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高純度佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的制備方法。該方法克服傳統(tǒng)分離技術(shù)的缺陷，采用高速逆流色譜法（HSCCC)制備高純度的佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素，該方法操作簡便，回收率高，分離量大。

本發(fā)明的一種高純度佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素的制備方法，包括：

(1)將A組分、B組分、C組分和D組分按體積比1-5:0.5-1.5:1-5:1-10混合后置于分液漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡20-40分鐘后，將上相和下相分開，即得該溶劑體系；其中A組分為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B組分為正丙醇或正丁醇；C組分為乙醇或甲醇；D組分為水；

(2)選擇上相為固定相，下相為流動(dòng)相，先用固定相充滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，將流動(dòng)相以0.5-5.0ml/min的流速泵入柱內(nèi)，待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；

(3)根據(jù)檢測(cè)器紫外圖譜接收目標(biāo)成分，將流分進(jìn)行濃縮、結(jié)晶，得到佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素。

上述溶劑體系優(yōu)選為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水體系。

所述步驟（2)中所進(jìn)的樣的制備方法為：將無花果提取物溶于上相和下相中。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丙醇-甲醇-水，該四組分的體積比依次為：1:1.5:1:1;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速850rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為5.0ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸甲酯-正丙醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：4:0.8:2:6;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速950rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為3.0ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：3:0.5:1:8;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速650rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為0·5ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：2:0.5:4:2;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速600rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為0·5ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：3:1:5:9;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速700rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為4.0ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：5:0.7:1:10;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速800rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為2.0ml/min。

所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：5:1.5:3:5;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速1000rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為3.0ml/min。

所述步驟（1)中的溶劑體系為乙酸丁酯-正丙醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：4:1:1:6;所述步驟（2)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速750rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為4.0ml/min。

根據(jù)溶解度常數(shù)，在不破壞體系平衡的情況下，調(diào)節(jié)A，B，C，D四組分的體積比。

高純度是指純度多98%，經(jīng)一次分離得到佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素純品，純度在98%以上。

實(shí)驗(yàn)條件適合溫度20-40°C，在上述溫度范圍內(nèi)，溫度較高時(shí)，出峰時(shí)間略有提前，分離效果變化不大，對(duì)峰形無多大影響。

主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速需控制在一定范圍內(nèi)，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時(shí)間后，將上相和下相分開，采用TBE-300B高速逆流色譜儀，該機(jī)型柱體積為300ml，進(jìn)樣圈為20ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測(cè)器和N2000色譜工作站。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，以0.5-5.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)。

分離和收集到的目標(biāo)成分，濃縮到一定純度后再進(jìn)行結(jié)晶得到單體。

本發(fā)明采用了高速逆流色譜分離技術(shù)克服了固態(tài)支持物或載體不可逆吸附、損耗和變性，使被分離物回收率高理論達(dá)100%，本發(fā)明實(shí)際達(dá)到95%以上，又因?yàn)椴捎脙?yōu)選的溶劑體系，控制實(shí)驗(yàn)條件溫度、調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得高純度的佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素（達(dá)到98%以上）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

選取乙酸甲酯-正丙醇-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為25°C，先按4:0.8:2:6體積比將上述溶劑組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測(cè)器和N2000色譜工作站。稱取300mg無花果粗樣溶解于10ml上相和10ml下相組成的溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為950rpm，以3.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測(cè)器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到98.5%。