背景[1-3]
Anti-Ubiquitin抗體是一類可以特異性結(jié)合Anti-Ubiquitin的多克隆抗體，主要用于檢測Anti-Ubiquitin的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中Anti-Ubiquitin水平。用純化的Anti-Ubiquitin抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Anti-Ubiquitin，再與HRP標(biāo)記的Anti-Ubiquitin抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Anti-Ubiquitin呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中Anti-Ubiquitin濃度。
ubiquitin是一種76個氨基酸殘基的高度保守的熱穩(wěn)定的小分子蛋白質(zhì)，最初從牛胸腺分離，隨后發(fā)現(xiàn)存在于所研究的所有組織的細胞中，包括動物、酵母、細菌和高等植物。核內(nèi)和胞質(zhì)中均存在，因其極為廣泛的分布而得此名。它與蛋白質(zhì)發(fā)生依賴于ATP的反應(yīng)，結(jié)果是其末端與蛋白質(zhì)的賴氨酸氨基縮合。
蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system(UPS))主要由泛素激活酶(E1)、泛素交聯(lián)酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體組成,是降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的主要途徑。此過程被一大分子的多蛋白復(fù)合體(26S的蛋白酶體:proteasome)所介導(dǎo)，如控制細胞周期的細胞周期蛋白的降解就是由泛素化觸發(fā)的。這樣，細胞有兩種降解蛋白的方式：泛素化和溶酶體中的蛋白酶解。這種被修飾過的蛋白迅速降解。
泛素是以多遍栽蛋白前體的形式被合成的，在最后一個重復(fù)后，額外存在一個最終氨基酸(如人中是纈氨酸)。人、牛和豬的遍在蛋白以及來自長尾倉鼠、大鼠、兔、光滑爪蟾、黑尾果蠅、地中海蠟實蠅以及昆蟲類的泛素具有完全相同的序列。
應(yīng)用[4][5]
用于Ubiquitin和p53在膽道系統(tǒng)腫瘤中的表達和意義研究
泛素蛋白和p53在膽道腫瘤與膽道炎性組織的表達差異,試圖找到膽道系統(tǒng)腫瘤發(fā)生機制,以提供一定的研究基礎(chǔ)。
方法:1收集臨床標(biāo)本,標(biāo)本固定在4%多聚甲醛與PBS的溶液中,4℃,持續(xù)24小時,采用免疫組織化學(xué)法檢測人膽道腫瘤組織、正常膽道組織以及炎性組織中泛素蛋白的表達及其表達水平,分析人膽道腫瘤組織中泛素蛋白的表達情況與不同臨床病理情況之間的相關(guān)性。
2膽囊癌、膽管癌、結(jié)石性膽囊炎膽囊組織收集同方法1,組織塊用RIPA裂解液(50mmol·L-1 Tris(PH8.0),150mmol·L-1 NaCl,1mmol·L-1 EDTA,1%NP-40,0.1%SDS),在裂解液中加入蛋白酶抑制劑,按1:100加入。得到總蛋白后,用蛋白電泳檢測蛋白中泛素蛋白和p53的表達情況。
3用半定量PCR技術(shù),我們檢測膽道腫瘤組織以及相應(yīng)癌旁組織中泛素mRNA水平。當(dāng)然,我們首先檢測膽管癌細胞系QBC-939的泛素mRNA情況。
結(jié)果:1人膽道腫瘤組織中泛素蛋白的表達顯著高于正常組織以及炎性組織中泛素蛋白的表達(p<0.05)。泛素蛋白的表達與病理組織學(xué)分級有明顯關(guān)系(p<0.05)。
參考文獻
[1]Oncogenic breakdowns in endocytic adaptor proteins[J].Nicola Crosetto,Ritva Tikkanen,Ivan Dikic.FEBS Letters.2005(15)
[2]The ubiquitin-mediated protein degradation pathway in cancer:therapeutic implications[J].Angelika M.Burger,Arun K.Seth.European Journal of Cancer.2004(15)
[3]Distinct monoubiquitin signals in receptor endocytosis[J].Kaisa Haglund,Pier Paolo Di Fiore,Ivan Dikic.Trends in Biochemical Sciences.2003(11)
[4]Unsaturated fatty acids bind Myc–Max transcription factor and inhibit Myc–Max–DNA complex formation[J].Sunah Chung,Seyeon Park,Chul-Hak Yang.Cancer Letters.2002(1)
[5]劉艷雷.Ubiquitin和p53在膽道系統(tǒng)腫瘤中的表達和意義[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2009.