Methotrexate通過主動轉(zhuǎn)運或易化擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過多聚谷氨酸化后，會抑制二氫葉酸還原酶和二氫葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸。Methotrexate抑制嘌呤和嘧啶的從頭合成，多胺的形成以及DNA、RNA、磷脂和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)甲基作用。Methotrexate也會抑制胸苷酸合成酶，從而使細(xì)胞內(nèi)胸苷酸不足，這可能導(dǎo)致抗增殖的細(xì)胞毒性作用。酶促反應(yīng)被Methotrexate的多聚谷氨酸化最有效抑制的是5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)轉(zhuǎn)化為甲酰-AICAR，反應(yīng)被AICAR甲?；D(zhuǎn)移酶抑制，因此導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AICAR的積累和腺苷釋放。 Methotrexate增加成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞中腺苷的釋放。Methotrexate顯著增加腺苷的釋放，在成纖維細(xì)胞中從總嘌呤釋放(EC50, 1 nM)的4%到31%，在內(nèi)皮細(xì)胞中，從24%到42%。通過暴露到受激的(fMet-Leu-Phe在0.1 μM下)中性粒細(xì)胞，Methotrexate增強的腺苷釋放，在成纖維細(xì)胞中進(jìn)一步增加到總嘌呤釋放的51% (EC50, 6 nM)，在內(nèi)皮細(xì)胞中增加到58%。 Methotrexate抑制免疫細(xì)胞趨藥性。Methotrexate (2.5微克/毫升)治療迅速降低多形核中性粒細(xì)胞PMNs的體外趨化反應(yīng)。 Methotrexate抑制炎癥細(xì)胞因子的活性。在體外實驗中，5 nM Methotrexate抑制IL-1活性，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。 Methotrexate誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。來自人類外周血液的T細(xì)胞體外活化后，Methotrexate (0.1-10 μM)會誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。

Methotrexate顯示出體內(nèi)抗炎作用。在小鼠氣囊炎模型中，Methotrexate以劑量依賴的方式使角叉菜膠處理過的空氣袋中聚集的白血球數(shù)量減少到60% (IC50 = 0.08 毫克/千克/周)。Methotrexate (0.5 毫克/千克/周)分別增加3倍的淋巴細(xì)胞中AICAR濃度，和2倍的炎性滲出物中腺苷濃度。