背景[1-6]
動物細胞基因組DNA提取試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)，提取組織和細胞的基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司特有新型材料，能夠高效、專一吸附DNA，可限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用本試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實驗。
操作步驟：
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入休積請參照瓶體上的標(biāo)簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1、樣品的處理：
a、細胞：取1×106-1×107個懸浮培養(yǎng)細胞，12000rpm離心1min收集細胞，貼壁細胞先用胰蛋白酶消化處理，再用預(yù)冷的PBS吹打成細胞懸液，然后12000rpm離心1min收集細胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩至徹底混勻。
b、組織：組織量不宜過大，一般不要超過25mg，可以使用勻漿器勻漿，用液氮研磨成粉末狀，再用預(yù)冷的PBS或無菌水充分懸浮，然后12000rpm離心1min收集細胞，盡量除去上清，加200ul溶液A，振蕩至徹底混勻。
2、向懸浮液中加入20ul的RNase A(10mg/ml)，55℃放置15min。
3、加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分顛倒混勻，55℃水浴消化，細胞消化時間較短，組織消化時間較長，一般需要1-3個小時才能完成（鼠尾需要消化過夜）。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，直至樣品消化完全為止。消化完全的指標(biāo)是：液體清亮及粘稠。
4、加入200ul體積溶液B，充分顛倒混勻，如出現(xiàn)白色沉淀，可放置于75℃15-30min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能導(dǎo)致提取的DNA量少及不純，還有可能導(dǎo)致堵塞吸附柱。
5、加入200ul無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中。
6、12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
9、12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。
10、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心2min。
11、可將離心所得洗脫液再加入吸附柱中，12000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。
注意事項:
1、試劑盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。
2、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量也下降。
3、如果試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響效果。
4、洗脫緩沖液的體積不少于50ul，體積過小會影響回收效率：洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。
應(yīng)用[7][8]
動物細胞基因組DNA提取試劑盒可用于動物組織及懸浮細胞基因組DNA提?。?/p>
在封閉群動物DNA多態(tài)性檢測方法的建立及應(yīng)用實驗中應(yīng)用篩選獲得的封閉群豚鼠多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,建立了適用于封閉群豚鼠遺傳質(zhì)量檢測的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法,并應(yīng)用該方法對2個豚鼠群體進行遺傳質(zhì)量檢測;同時,應(yīng)用篩選獲得的封閉群兔SNP位點,建立了適用于封閉群兔遺傳質(zhì)量檢測的SNP遺傳檢測方法,并用該方法分析了3個封閉群兔的遺傳多樣性。
為實驗動物的遺傳質(zhì)量控制提供新的遺傳檢測手段。閉群豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記檢測方法的建立及初步應(yīng)用首先,通過比較新鮮抗凝血Na I手提法、血凝塊手提法和試劑盒DNA提取法三種血液基因組DNA提取方法,為后續(xù)實驗提供簡便、快捷的DNA提取方法。其次,根據(jù)相關(guān)文獻挑選出40個富含多態(tài)性的豚鼠微衛(wèi)星位點,經(jīng)過PCR條件優(yōu)化、3%瓊脂糖凝膠電泳和STR掃描篩選共獲得25個擴增條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星位點。
再有,采用篩選出的25個多態(tài)性微衛(wèi)星位點,建立封閉群豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳質(zhì)量檢測方法,對A、B兩個封閉群豚鼠進行遺傳質(zhì)量檢測,并計算其群體遺傳學(xué)參數(shù),包括平均觀測等位基因數(shù)、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量等,然后進行了Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗和雜合子缺失檢驗。
參考文獻
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[8]李芳芳.豚鼠和家兔封閉群動物DNA多態(tài)性檢測方法的建立及應(yīng)用[D].中國食品藥品檢定研究院,2015.