動物/細胞基因組DNA提取試劑盒（目錄號：RTG2402）

● 試劑盒內容及保存：

● 儲存條件和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件下，若溶液產生沉淀，應在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的蛋白酶K和RNaseA收到后按照需要分裝成小管，-20℃保存。

● 產品簡介：

本試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)，能提取多種細胞/組織中的基因組DNA。離心吸附柱可以高效、專一吸附DNA，可限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質量穩(wěn)定可靠。

使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構建、Southern雜交等實驗。

● 提取得率：

● 準備工作：

1. 準備55℃和70℃水?。粺o水乙醇；1.5ml滅菌離心管。

2. 按照標簽所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

3. 每次使用前請檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1. 處理材料：

a. 培養(yǎng)細胞：貼壁培養(yǎng)的細胞應先處理為細胞懸液（如用PBS緩沖液或類似緩沖液），10,000 g離心1分鐘，倒盡上清，加入200 μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。

b. 組織：取約30mg動物組織（脾組織用量應少于10 mg）加入到事先盛有200μl 緩沖液GA的1.5ml離心管中，用研磨杵徹底將組織研碎。

2. 加入20 μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取細胞基因組時，加入蛋白酶K混勻后，55℃放置5-10分鐘。

b. 提取組織基因組時，加入蛋白酶K混勻后，在55℃放置，直至組織溶解。

注：不同組織裂解時間不同，通常需1-3小時即可完成（鼠尾需要消化過夜）,期間間歇顛倒混勻樣品。

3. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

4. 加入220 μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

注：加入緩沖液GB時可能會產生白色沉淀，一般70℃放置一段時間后會消失。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，會影響DNA的純度和得率，而且可能導致步驟6中離心柱堵塞。

5．加入220 μl 無水乙醇，顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

注：加入乙醇后會產生絮狀沉淀，可用槍頭反復抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理，容易導致步驟6中離心柱的堵塞。

6．將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：如果出現(xiàn)吸附柱堵塞現(xiàn)象，可將離心時間延長到5分鐘。

7．向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

8．向吸附柱CG中加入700 μl 漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

9．向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11,000g離心1分鐘，倒掉廢液。

10．將吸附柱CG放回廢液收集管中，11,000g離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

11．將吸附柱CG轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μl經(jīng)70℃水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11,000g離心2分鐘。

注；1. 洗脫緩沖液體積不少于100 μl，體積過小影響回收效率。

2. 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

12. DNA產物-20℃保存。