背景[1-3]
端粒酶（Telomerase），在細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒的延長(zhǎng)的一種酶，是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端，把DNA復(fù)制損失的端粒填補(bǔ)起來(lái)，使端粒修復(fù)延長(zhǎng)，可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗，使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短端粒（縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限），從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，在腫瘤中被重新激活，從而可能參與惡性轉(zhuǎn)化。端粒酶在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的存在，就是把DNA復(fù)制的缺陷填補(bǔ)起來(lái)，即把端粒修復(fù)延長(zhǎng)，可以讓端粒不會(huì)因細(xì)胞分裂而有所損耗，使得細(xì)胞分裂的次數(shù)增加。
端粒（Telomere）是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”結(jié)構(gòu)，作用是保持染色體的完整性和控制細(xì)胞分裂周期。
端粒酶
人類TERC（也被稱為人類端粒酶RNA的TR或hTR）基因于1995年被克隆，并且在所有正常人類細(xì)胞中普遍表達(dá)。編碼端粒酶催化亞基的人類TERT（也稱為hTERT）基因于1997年被克隆。TERT在大多數(shù)正常人細(xì)胞中未檢測(cè)到，但在幾乎所有癌癥細(xì)胞中都有表達(dá)，并迅速被認(rèn)為是晚期人類癌癥的一個(gè)幾乎通用的標(biāo)記物。由于很難獲得足夠大的腫瘤樣本用于Greider和Blackburn的經(jīng)典引物延伸端粒酶活性測(cè)定，因此病理學(xué)家急切地采用了一種基于PCR的測(cè)定，即端粒重復(fù)擴(kuò)增方案（TRAP），來(lái)檢測(cè)檔案庫(kù)中感興趣的腫瘤類型。
由于大多數(shù)正常組織中沒有端粒酶活性，而且?guī)缀跛腥祟惸[瘤（85-90%）不僅組成性表達(dá)端粒酶，而且端粒也較短，因此抑制端粒酶成為并仍然是癌癥治療的一個(gè)誘人靶點(diǎn)。然而，到目前為止，還沒有任何抗端粒酶療法被批準(zhǔn)用于任何適應(yīng)癥。這當(dāng)然不是因?yàn)槿狈L試，但很可能是由于從抑制端粒酶到端粒短到足以導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入危機(jī)并發(fā)生凋亡的漫長(zhǎng)滯后期。此外，由于正常細(xì)胞如造血增殖細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)端粒酶活性，限速毒性作用降低了直接端粒酶抑制劑的效用。此外，在一些較罕見的癌癥類型中，基于ALT的維持機(jī)制可能涉及DNA重組14，因此人們擔(dān)心有效的端粒酶抑制劑可能參與這種基于ALT生存途徑。
應(yīng)用[4][5]
端粒酶可以用于基于氧化型TMB和雙發(fā)射熒光比率探針靈敏檢測(cè)端粒酶
建立了三種簡(jiǎn)便檢測(cè)端粒酶的新方法。一方面,基于3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化前后產(chǎn)生的顏色變化,以及產(chǎn)生相應(yīng)的光熱效應(yīng),建立了一種比色和光熱同時(shí)檢測(cè)端粒酶活性的新方法;另一方面,基于比率型熒光探針,建立了兩種熒光檢測(cè)端粒酶活性的新方法。
具體研究?jī)?nèi)容如下:第一,基于氧化型TMB比色和光熱雙模式靈敏檢測(cè)端粒酶。G-四聯(lián)體（G-quadruplex）是由富G的DNA序列折疊形成的。氯化血紅素（Hemin）能夠嵌入G-四聯(lián)體中,形成一種具有催化活性的DNA模擬酶（DNA酶,DNAzyme）。本文利用端粒酶延伸產(chǎn)物重復(fù)序列（TTAGGG）富含G堿基,能夠形成G-四聯(lián)體的特點(diǎn),加入血紅素形成DNAzyme。這種DNA酶能夠有效催化TMB和H2O2溶液發(fā)生氧化反應(yīng),生成氧化TMB（ox TMB）,顏色由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色,實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)。隨著端粒酶延伸產(chǎn)物的增多,樣品溶液藍(lán)色逐漸加深;同時(shí),溶液在650 nm處的吸光度逐漸增強(qiáng)。我們可以根據(jù)吸光度的變化,更加準(zhǔn)確的對(duì)端粒酶進(jìn)行定量檢測(cè)。而且,ox TMB可以作為光熱探針,通過(guò)激光誘導(dǎo)光熱效應(yīng),將光轉(zhuǎn)化為熱,通過(guò)檢測(cè)溫度的變化可以實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶的定量檢測(cè)。
第二,基于雙發(fā)射熒光比率探針結(jié)合端粒酶延伸產(chǎn)物自放大效應(yīng)檢測(cè)端粒酶。在這部分研究中,我們利用功能化的磁性微球（表面標(biāo)記鏈霉親和素STV的磁球）的富集和分離作用來(lái)提高方法的選擇性和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。首先通過(guò)STV與生物素（biotin）的特異性作用,將端粒酶延伸產(chǎn)物富集于磁球表面。然后加入一端標(biāo)記有葡萄糖氧化酶（GOD）,堿基序列與端粒酶延伸產(chǎn)物兩個(gè)重復(fù)序列互補(bǔ)的DNA探針（MP-GOD）進(jìn)行雜交反應(yīng)。GOD就會(huì)連接到磁球表面上。由于端粒酶延伸產(chǎn)物包含有多個(gè)重復(fù)序列,能夠捕捉多個(gè)MP-GOD探針,形成自放大效應(yīng)。端粒酶的含量越多,那么富集在磁球表面的GOD就越多。被磁球捕捉的GOD與加入的葡萄糖反應(yīng),生成相對(duì)應(yīng)量的雙氧水（H2O2）。生成的H2O2猝滅雙發(fā)射熒光探針外層綠色量子點(diǎn),顯示出內(nèi)層紅色熒光染料的熒光,以此實(shí)現(xiàn)端粒酶的可視化熒光檢測(cè)。
第三,基于雙發(fā)射熒光比率探針結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）信號(hào)放大靈敏檢測(cè)端粒酶。首先,通過(guò)STV與生物素（biotin）的特異性作用,將端粒酶延伸產(chǎn)物富集于磁球表面。然后,一個(gè)DNA探針與端粒酶延伸產(chǎn)物重復(fù)序列雜交,并引發(fā)標(biāo)記有GOD的另外兩個(gè)DNA探針在磁球表面形成交替雜交,形成雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大。大量的GOD就會(huì)連接到磁球表面上,通過(guò)GOD與葡萄糖反應(yīng)生成H2O2,H2O2猝滅雙發(fā)射熒光探針外層綠色量子點(diǎn)的熒光,顯示出內(nèi)層紅色熒光染料的熒光,以此實(shí)現(xiàn)端粒酶的可視化熒光檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)
[1]CuS quantum dots activated DNAzyme for ratiometric electrochemical detection of telomerase activity[J].Sun Yujie;Dong Qi;Yang Huan;Song Weiling;Zhou Hong.Analytica Chimica Acta.2023
[2]Sensitive and amplification-free detection of telomerase activity by self-extension of telomerase and trans-cleavage of CRISPR/Cas12a[J].Wang Honghong;Wang Shuhui;Wang Hui;Liang Yuanwen;Li Zhengping.Talanta.2023
[3]Label-free palindromic DNA nanospheres as naked-eye colorimetric assay platform for detection of telomerase activity[J].He Jing-Lin;Tang Ling;Liao Shi-Qing;Guo Mei-Tong;Wu Ling;Song Yinghui;Liu Sulai;Cao Zhong.Talanta.2023
[4]A ratiometric fluorescent biosensor based on magnetic-assisted hybridization chain reaction and DNA-templated silver nanoclusters for sensitive microRNA detection[J].Wong Zheng Wei;Muthoosamy Kasturi;Mohamed Nur Aliana Hidayah;New Siu Yee.Biosensors and Bioelectronics:X.2022
[5]畢曉涵.基于氧化型TMB和雙發(fā)射熒光比率探針靈敏檢測(cè)端粒酶[D].河北大學(xué),2023.