簡述
軟骨素硫酸鹽又名硫酸軟骨素（分子式：C13H21NO16S，分子量為479.368），是從動物軟骨中提取的硫酸軟骨素A，和C等酸性粘多糖的混合物。該物質(zhì)呈白色或淡黃色粉末狀，無味，無臭，有吸濕性，易溶于水而呈粘度較大的溶液，不溶于乙醇，丙酮和乙醚等有機溶劑中，其鹽類對熱較穩(wěn)定[1]。
以牛鼻軟骨為原料，采用增大堿濃度提取，復(fù)合酶水解及濃縮后酒精沉淀的方法實現(xiàn)軟骨素硫酸鹽的生產(chǎn)，在最佳實驗條件下，得到軟骨素硫酸鹽為白色粉末，其純度達(dá)95.2%，收率為32.6%，可有效提高產(chǎn)品純度和收率，值得推廣應(yīng)用[2]。
測定方法
間苯三酚分光光度法
利用含有間苯三酚的無機酸與樣品中軟骨素硫酸鹽反應(yīng)生成肯色產(chǎn)物進(jìn)行分光光度分析。結(jié)果：100℃反應(yīng)30min在波長558nm處測定軟骨素硫酸鹽，在0.10~1.0mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9993)，具有較好重現(xiàn)性。此法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確[3]。
天青A分光光度法
利用軟骨素硫酸鹽與天青A作用后，其復(fù)合物溶液在625 nm處吸光值與軟骨素硫酸鹽濃度成線性關(guān)系的特點，建立一種測定中藥復(fù)方樣品中軟骨素硫酸鹽含量的快速，簡便，靈敏的分光光度法。該方法在0～30 μg*mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R=0.999)，回收率范圍為97.4%～103.8%[4]。
藥理活性研究
軟骨素硫酸鹽主要應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎、滴眼液等，具有止痛，促進(jìn)軟骨再生的功效，對改善老年退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的效果，可以改善關(guān)節(jié)問題。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，它可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制其轉(zhuǎn)移。
為了觀察軟骨素硫酸鹽對阿霉素作用下HL60細(xì)胞增殖分化的影響，設(shè)計開放性實驗，方法如下：
①細(xì)胞傳代培養(yǎng)后將進(jìn)入對數(shù)增殖期的細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.1滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成1×108L-1的細(xì)胞懸液，分裝于45個培養(yǎng)瓶中，4mL/瓶。
②取分裝好的細(xì)胞懸液15瓶，按照0，5，25，50，75mg/L濃度加入軟骨素硫酸鹽，每個濃度平行3瓶，空白對照組加入等量的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。采取細(xì)胞計數(shù)法測定軟骨素硫酸鹽處理后的HL60細(xì)胞密度的變化。
③取分裝好的細(xì)胞懸液30瓶，分為軟骨素硫酸鹽+阿霉素組，軟骨素硫酸鹽組，各15瓶。按照0，5，25，50，75mg/L濃度向兩組加入軟骨素硫酸鹽，每個濃度平行3瓶，空白對照組加入等量的0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液。用MTT法測定軟骨素硫酸鹽處理后的HL60細(xì)胞加入阿霉素后細(xì)胞存活率的變化。
④取分裝好的細(xì)胞懸液15瓶，按照0，5，25，50，75mg/L濃度加入軟骨素硫酸鹽，每個濃度平行3瓶，空白對照組加入等量的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測定各組細(xì)胞的酸性磷酸酶活性，觀察其對細(xì)胞分化的影響。
主要觀察指標(biāo)：①軟骨素硫酸鹽對HL60細(xì)胞增殖的影響；②軟骨素硫酸鹽+阿霉素對HL60細(xì)胞存活率的影響；③軟骨素硫酸鹽對HL60細(xì)胞酸性磷酸酶活性的影響。
結(jié)果：①與空白對照組比較，不同濃度軟骨素硫酸鹽處理24h后HL60細(xì)胞密度均顯著升高(P0.01)；且50，75mg/L軟骨素硫酸鹽濃度組的細(xì)胞密度升高尤為明顯，但兩組間比較基本相似(P0.05)，說明在這個濃度范圍內(nèi)硫酸軟骨素對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用變化不大。②與空白對照組比較，加入不同濃度軟骨素硫酸鹽后，軟骨素硫酸鹽+阿霉素組細(xì)胞存活率均有不同程度的降低，軟骨素硫酸鹽濃度超過25mg/L時降低明顯(P0.01)。③與空白對照組比較，5，25，50mg/L軟骨素硫酸鹽濃度組HL60細(xì)胞酸性磷酸酶吸光度值均明顯升高(1.268±0.038，1.305±0.101，1.321±0.021，1.354±0.013，P0.01或0.05)，尤其是75mg/L軟骨素硫酸鹽濃度組HL60細(xì)胞酸性磷酸酶吸光度值高達(dá)1.406±0.113，與空白對照組比較差異有極顯著意義(P0.001)。
故可得出結(jié)論，軟骨素硫酸鹽在適當(dāng)濃度時對HL60細(xì)胞的增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用，可提高HL60細(xì)胞對阿霉素的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞分化[5]。
參考文獻(xiàn)
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[3]高華,劉坤,于茲東,等.間苯三酚分光光度法測定硫酸軟骨素的研究[J].中國生化藥物雜志, 2000, 21(5):2.DOI:10.3969/j.issn.1005-1678.2000.05.012.
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[5]徐文華,虞浩,張銀亭,et al.硫酸軟骨素對HL60細(xì)胞增殖分化的影響[J].中國臨床康復(fù), 2006, 10(37):166-168.DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2006.37.039.