背景[1-6]
NEDD4-2 Rabbit Monoclonal Antibody（NEDD4-2兔單克隆抗體）是用NEDD4-2抗原對(duì)家兔進(jìn)行免疫后篩選出只產(chǎn)生的NEDD4-2的B淋巴細(xì)胞，再將B細(xì)胞通過細(xì)胞融合技術(shù)與骨髓瘤雜交然后篩選出只分泌NEDD4-2抗體的雜交細(xì)胞，最后通過層析柱純化制的高純度的NEDD4-2兔單克隆抗體。
NEDD4-L(神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)，發(fā)育下調(diào)4樣)，又稱RSP5、NEDD4-2或NEDL3，是一種定位于細(xì)胞質(zhì)的975個(gè)氨基酸蛋白，包含四個(gè)WW結(jié)構(gòu)域、一個(gè)HECT結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2結(jié)構(gòu)域。
NEDD4-L在胰腺、前列腺和腎臟中廣泛表達(dá)，是一種E3泛素蛋白連接酶，具有E3連接酶蛋白的特性，它從E2泛素偶聯(lián)酶中接受泛素(以硫酯的形式)，并將泛素殘基轉(zhuǎn)移到降解的底物上。通過其ubiquitinate能力和誘導(dǎo)等蛋白質(zhì)的蛋白酶體依賴降解Smad2和TGFβRII,NEDD4-L被認(rèn)為抑制TGFβ信號(hào)通路,從而調(diào)節(jié)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的信號(hào)通路。由于可變剪接區(qū)間，NEDD4-L被表示為8種亞型。NEDD4是一種E3泛素連接酶，其靶向蛋白質(zhì)以進(jìn)行泛素化。
NEDD4是真核生物中高度保守的基因，是E3 HECT泛素連接酶NEDD4家族的創(chuàng)始成員，由人類中的9個(gè)成員組成NEDD4（該基因），NEDD4-2（NEDD4L），ITCH，SMURF1，SMURF2，WWP1，WWP2，NEDL1（HECW1）和NEDDL2（HECW2）。NEDD4通過泛素化和內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)大量膜蛋白，如離子通道和膜受體。NEDD4蛋白廣泛表達(dá)，并且已經(jīng)預(yù)測(cè)或證明大量蛋白質(zhì)在體外結(jié)合。體內(nèi)NEDD4參與多種過程的調(diào)節(jié)，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和病毒出芽。
NEDD4是動(dòng)物發(fā)育和生存的必需蛋白質(zhì)。NEDD4蛋白具有模塊結(jié)構(gòu)，其在NEDD4家族中共享，由氨基末端C2鈣依賴性磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域，3-4WW蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和羧基末端催化HECT泛素連接酶結(jié)構(gòu)域組成。C2結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向磷脂膜，也可以參與靶向底物。WW結(jié)構(gòu)域與靶蛋白中富含脯氨酸的PPxY基序相互作用，介導(dǎo)與底物和銜接子的相互作用。所述的催化HECT結(jié)構(gòu)域形成與從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移活化泛素硫酯鍵，直接轉(zhuǎn)移到泛素的特異性底物之前。
在體外，已顯示NEDD4結(jié)合并泛素化許多離子通道和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致其隨后的蛋白酶體內(nèi)吞作用和降解，包括上皮鈉通道（ENaC），電壓門控鈣和電壓門控鈉通道。NEDD4介導(dǎo)泛素化和隨后下調(diào)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）信號(hào)通路的組分，例如HER3和HER4 EGF受體，以及ACK。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（FGFR1）經(jīng)歷NEDD4介導(dǎo)的遍在蛋白化和下調(diào)，并且有趣地包含結(jié)合NEDD4的C2和WW3結(jié)構(gòu)域的新位點(diǎn)。
通過對(duì)多種病毒進(jìn)行病毒基質(zhì)蛋白的泛素化，NEDD4在病毒出芽中起作用，NEDD4也與出芽所需的內(nèi)吞機(jī)制的組分相互作用。NEDD4也可以獨(dú)立于其泛素連接酶活性起作用。NEDD4與VEGFR2相互作用，導(dǎo)致VEGFR2的降解，而不管HECT結(jié)構(gòu)域是否具有催化活性。NEDD4可以結(jié)合并遍在上皮鈉通道（ENaC），導(dǎo)致鈉通道活性的下調(diào)。然而，體內(nèi)研究表明NEDD4家族成員NEDD4-2是負(fù)責(zé)ENaC調(diào)節(jié)的主要連接酶。
應(yīng)用[7][8]
NEDD4-2兔單克隆抗體可用于NEDD4-2蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路的分子機(jī)制研究：
Angiomotin(AMOT)是一個(gè)在內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)表達(dá)的膜相關(guān)蛋白,它能夠調(diào)控遷移,緊密連接(TJ)形成,細(xì)胞極性以及血管生成。在最近的研究中也揭示了AMOT,以及兩個(gè)AMOT家族成員AMOTL1和AMOTL2都通過調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ的亞細(xì)胞定位,從而在Hippo pathway中發(fā)揮了重要的作用。但是,在細(xì)胞中AMOT受到了哪些調(diào)控目前為止還不是特別清楚。
在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)了AMOT在細(xì)胞受到泛素化降解。當(dāng)293T細(xì)胞用蛋白酶體抑制劑MG132或者lactacystin處理后,AMOT蛋白量顯著升高。由于AMOT受到泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控,我們便尋找負(fù)責(zé)介導(dǎo)AMOT泛素化的相關(guān)E3連接酶。在多個(gè)物種的AMOT同源蛋白序列比對(duì)分析中,我們發(fā)現(xiàn)在AMOT/p130,AMOTL1和AMOTL2的N端部分都含有三個(gè)保守的L/P-P-X-Y motifs(除了AMOT/p80)。而L/P-P-X-Y motifs可以和含有WW domain的蛋白質(zhì)相互作用,比如說Nedd4-like E3 ubiquitin ligases家族。
所以我們對(duì)一些Nedd4-like E3 ubiquitin ligases家族成員做了一遍篩查,發(fā)現(xiàn)Nedd4,Nedd4-2和Itch可以降解AMOT的長(zhǎng)剪接本AMOT/p130,而不能降解其短剪接本AMOT/p80。我們的數(shù)據(jù)顯示Nedd4,Nedd4-2和Itch可以有效降解AMOT/p130,并且其降解作用呈劑量依賴效應(yīng),并且Nedd4,Nedd4-2和Itch也可以促進(jìn)AMOT L1的降解,但是卻不能促進(jìn)AMOT L2的降解。我們證明了Nedd4,Nedd4-2和Itch能夠在體內(nèi)對(duì)AMOT/p130進(jìn)行泛素化修飾。而且超表達(dá)Nedd4,Nedd4-2和Itch可以導(dǎo)致AMOT/p130的泛素化降解。
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