活性氧（ROS）是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等。它們在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，但過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并與多種疾病有關(guān)。目前針對ROS的檢測方法包括熒光染色法、化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振技術(shù)（EPR/ESR）、電化學(xué)生物傳感器、色譜法、分光光度法和基于熒光蛋白的方法（表1）。 

表1    常用ROS的檢測方法

檢測ROS水平對于理解細(xì)胞生理功能和環(huán)境因素導(dǎo)致的細(xì)胞損傷至關(guān)重要。今天小愛帶大家重點(diǎn)了解熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的原理及具體操作步驟。
 

活性氧檢測攻略

一、選擇合適的探針

DCFH-DA：這是一種常用的熒光探針，通過檢測其氧化產(chǎn)物DCF的熒光強(qiáng)度來定量細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解生成DCFH，隨后被氧化生成DCF，其熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比。

圖1  DCFH-DA探針在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制^[1]

二、 實(shí)驗(yàn)步驟（以abs580232，活性氧ROS檢測試劑盒為例）

1、裝載ROS探針

（1）原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測時(shí)細(xì)胞數(shù)量小于5×10⁵/mL。

② 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類型決定。

③（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30 min-4 h，以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類型存在差異。例如：HeLa細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90 min。

④ ROS探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

⑤ ROS探針裝載：吸除處理藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積需充分蓋住細(xì)胞。例如：6孔板通常不少于1 mL，對于96孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。

⑥ 細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

（2）收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測用細(xì)胞狀態(tài)。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

② 藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間由藥物特性和細(xì)胞類型決定。

③（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，37℃避光孵育30 min-4 h以提高活性氧水平，不同細(xì)胞類型存在差異。例如：HeLa細(xì)胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞則需孵育90 min。

④ ROS探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

⑤ 探針裝載：除去細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1.0×10⁶ - 2.0×10⁷。注意：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進(jìn)行調(diào)整。例如：對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于10⁴，也不可多于10⁶。

⑥ 細(xì)胞清洗：用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1-2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2、熒光顯微鏡檢測

1、對貼壁生長細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細(xì)胞，取 25-50 μL 細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

2、熒光顯微鏡下，選用 FITC 濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3、流式細(xì)胞儀分析

1、對貼壁生長細(xì)胞，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對懸浮生長細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。用 0.5-1 mL PBS 重懸細(xì)胞(0.5-1×10⁵/mL)。

2、選擇流式細(xì)胞儀 FL1 或BL1 通道，488 nm激發(fā)，測定 530 nm 的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS 陽性細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光。

DCFH-DA在ROS檢測中的應(yīng)用

Gao^[2]等采用標(biāo)準(zhǔn)熒光探針 2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸(abs42197174，DCFH-DA) 來測定脂質(zhì)體處理后4T1細(xì)胞內(nèi)的 ROS。具體操作流程如下：

1、將 4T1細(xì)胞接種在 35 mm 培養(yǎng)皿中，密度為 8×10⁴ 細(xì)胞/孔。

2、細(xì)胞培養(yǎng)24 小時(shí)匯合度達(dá)到 70–80%后，將脂質(zhì)體（1 mL，0.1 mg/mL）加入培養(yǎng)基中。配方處理 6 小時(shí)后，用 PBS 洗滌細(xì)胞三次。

3、用 DCFH-DA（abs42197174，10 μM）染色，孵育 30 分鐘后，用 PBS 洗滌細(xì)胞三次，然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行 CLSM 成像。

圖2  4T1 細(xì)胞中的 ROS 成像^[2]

無論脂質(zhì)體類型如何，巖藻糖工程化脂質(zhì)體在4T1細(xì)胞中產(chǎn)生的 ROS 都比非靶向脂質(zhì)體多（圖 2），主要是因?yàn)榧?xì)胞攝取增強(qiáng)。由于 DAPC 過氧化，DAPC-Fuc 在 ROS 生成方面比 DOPC-Fuc 更有效。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio Protoc. 2017;7(17):e2545. 

[2] Gao Z, Zhang J, Hou Y, et al. Boosting the synergism between cancer ferroptosis and immunotherapy via targeted stimuli-responsive liposomes[J]. Biomaterials.2024;305:122442. 

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