細(xì)胞凋亡檢測中 Annexin V 與 7 - 氨基放線菌素（7 - amino - actinomycin D，7 - AAD）或碘化丙啶（Propidium iodide，PI）雙染法的原理

在正常狀態(tài)下，活細(xì)胞的細(xì)胞膜完整無損，其中的磷脂酰絲氨酸（PS）作為細(xì)胞膜的一個(gè)組分，處于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)。而一旦細(xì)胞啟動(dòng)凋亡進(jìn)程，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)隨即發(fā)生變化，致使原本位于內(nèi)側(cè)的 PS 翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面，且這一現(xiàn)象在凋亡早期便已發(fā)生。鑒于此，可利用對(duì) PS 具有高度親和力且標(biāo)記有熒光素的膜連蛋白 V（Annexin V）對(duì)早期凋亡細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)檢測。

不過，由于晚期凋亡細(xì)胞以及部分壞死細(xì)胞同樣能夠與 Annexin V 相結(jié)合，所以有必要引入另一項(xiàng)評(píng)判指標(biāo)，也就是細(xì)胞膜的通透性。與正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞相比，晚期凋亡及壞死細(xì)胞的膜通透性顯著增加。如此一來，某些在正常情況下無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的核酸染料，例如 7 - AAD 和 PI，便能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與 DNA 相結(jié)合。

綜上所述，借助 Annexin V 和 7 - AAD/PI 雙染的檢測手段，就能夠有效地將早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡及壞死細(xì)胞清晰地區(qū)分開來，從而為細(xì)胞凋亡狀態(tài)的準(zhǔn)確判定提供有力依據(jù)。

Annexin V和7-AAD雙標(biāo)測凋亡流式染色實(shí)例

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（數(shù)量為每樣 2 - 5×105 個(gè)）Annexin V 與 7 - AAD 雙染實(shí)例剖析（本實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞凋亡由紫外線 30 分鐘照射誘導(dǎo)）

一、標(biāo)志物特征
活細(xì)胞呈現(xiàn) Annexin V - 7 - AAD - ；早期凋亡細(xì)胞為 Annexin V + 7 - AAD - ；晚期凋亡及壞死細(xì)胞表現(xiàn)為 Annexin V + 7 - AAD + ；特定壞死細(xì)胞則是 Annexin V - 7 - AAD + 。

二、流式細(xì)胞儀型號(hào)
采用 BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

三、流式抗體及用量詳情
使用 1×Binding Buffer（每測試 250ul，聯(lián)科生物的 5×Binding Buffer 用 ddH2O 配制，貨號(hào)：LK - AP101 - 100 - BB）；Annexin V - APC（每測試 1ul，貨號(hào)：BMS306APC，eBioscience）；7 - AAD（每測試 5ul，貨號(hào)：559925，BD）。

四、染色條件說明
本實(shí)例運(yùn)用胰酶消化細(xì)胞后進(jìn)行染色操作，且未對(duì)細(xì)胞表面分子染色。若需標(biāo)記表面分子，切不可使用胰酶，應(yīng)先按常規(guī)染法標(biāo)記表面分子，洗凈多余抗體后，用 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，再加入 Annexin V 和 7 - AAD，于室溫避光孵育 15 分鐘。因該法中細(xì)胞未固定，染色后需盡快開展檢測工作。

五、分析軟件信息
運(yùn)用 Cell Quest 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

六、圈門策略與染色情況
FSC/SSC 圈門策略依不同細(xì)胞類型而定（本實(shí)例見上圖）。

七、常見問題及提示
A. 鑒于細(xì)胞凋亡受細(xì)胞種類、體內(nèi)外環(huán)境、外界刺激以及染色操作等多種因素影響而存在顯著差異，利用 Annexin V 和 7 - AAD 雙染檢測凋亡時(shí)，需依據(jù)各自實(shí)驗(yàn)情形開展多次實(shí)驗(yàn)，以精準(zhǔn)把握特定實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞凋亡的規(guī)律與特征。
B. Annexin V 染色具有特殊表現(xiàn)，未凋亡細(xì)胞（Annexin V - 7 - AAD - 細(xì)胞）經(jīng)染色后在流式圖上位置會(huì)向右偏移。經(jīng)與眾多從事凋亡研究的同行交流得知，此為 Annexin V 染色特有的現(xiàn)象，無需詫異。曾嘗試通過洗凈多余抗體將活細(xì)胞群（Annexin V - 7 - AAD - 細(xì)胞群）調(diào)整至常規(guī)認(rèn)知的 “陰性細(xì)胞” 位置，但從實(shí)例圖可看出該方法無效。至于洗凈多余抗體無法解決 “移位” 問題的原因，目前尚不明晰，僅建議不要采用此方法調(diào)整細(xì)胞在圖中的位置，因?yàn)榍逑春蟾魅杭?xì)胞比例會(huì)發(fā)生改變。
C. 因?qū)嶒?yàn)中細(xì)胞獲取不易，本實(shí)例采用細(xì)胞數(shù)量較少。若實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量充足達(dá) 106 級(jí)別，可采用 300ul - 500ul 體系，添加 2ul - 5ul Annexin V 和 10ul 7 - AAD，具體染色條件可通過滴度實(shí)驗(yàn)自行確定。
D. 使用 Annexin V 和 PI 試劑盒的人員可依照試劑盒說明書進(jìn)行染色操作。
E. 該方法上機(jī)檢測過程與一般分子上機(jī)檢測相似，無特殊之處，無需過度擔(dān)憂。使用 PI 的人員需注意，PI 發(fā)射譜較寬，可選用第二或第三通道檢測，任選其一即可。同時(shí)，在進(jìn)行 FSC/SSC 圈門時(shí)，所選細(xì)胞范圍對(duì)結(jié)果影響較大，分析時(shí)應(yīng)將所有分析對(duì)象納入 FSC/SSC 門內(nèi)，以確保結(jié)果真實(shí)可靠。
F. 本法優(yōu)勢在于無需固定細(xì)胞且染色快速，但存在不足，當(dāng)細(xì)胞膜破裂時(shí) Annexin V 也可與細(xì)胞結(jié)合，并且在部分自噬受損細(xì)胞中，PS 外翻可能受阻，此時(shí) Annexin V 不適用于早期凋亡檢測。

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