免疫刺激抗體偶聯(lián)物（ISAC）將腫瘤靶向單克隆抗體與免疫刺激劑結合起來，將免疫激活劑靶向遞送到腫瘤微環(huán)境中，激活免疫系統(tǒng)對抗腫瘤。

NJH395是一種新型的免疫刺激抗體偶聯(lián)物（ISAC），由諾華公司開發(fā)，用于治療非乳腺癌HER2+晚期惡性腫瘤。這種藥物結合了HER2抗體和TLR7激動劑?？笻ER2單克隆抗體（曲妥珠單抗的半胱氨酸工程變體，MIW338）與TLR7激動劑共價連接組成的ISAC。NJH395在腫瘤細胞表面與HER2結合，進而內吞釋放毒素。TLR7的激活誘導了I型IFN反應，引起腫瘤微環(huán)境中免疫反應，主要表現(xiàn)為髓系細胞增殖和T細胞活，促進腫瘤特異性免疫記憶和抗腫瘤反應。

 圖：抗HER2-TLR7 ISAC NJH395的作用機制。

MIW338是一種結合HER2的人源化單克隆抗體，屬于IgG1/κ同種型亞類，與曲妥珠單抗（Trastuzumab）序列相似。在MIW338中引入四個半胱氨酸殘基，不會影響與HER2和FcγR結合；通過馬來酰亞胺與TLR7激動劑進行位點特異性偶聯(lián)，采用非可裂解Linker來提供穩(wěn)定性，最大程度地減少免疫毒性。

利用NJH395及MIW338處理HER2+乳腺癌細胞HCC1954，實驗數(shù)據(jù)表明，二者可與靶細胞結合，同型對照不會；可檢測到NJH395在HCC1954細胞中的內化作用，但NJH397(同種型對照ISAC )未見內化。NJH395與N87胃癌細胞的體外孵育可打開馬來酰亞胺環(huán)，表明NJH395在內化后被溶酶體加工產生活性分解代謝物，主要由MIM697 (Cys-Linker-Payload)和次要分解代謝物YFB712組成。利用這些分解代謝物在體外測定TLR激活效果，MIM697，YFB712在HEK293-TLR7細胞系中評估了NF-kB報告基因下游的熒光素酶的活性。此外，MIM697呈現(xiàn)出TLR7特異性，其在HEK-TLR8報告基因測定中沒有表現(xiàn)出顯著活性。

MIM697和YFB712誘導IFNα 和IL6分泌，表明人PBMC中TLR7的強烈激活。NJH395或MIW338全血檢測，qPCR結果顯示NJH395處理組的TNFα、IL6和IL1β基因上調，MIW338處理組沒有上調，TLR7下游信號通路中的OAS1和OAS2上調，表明這些上調是由TLR7激動作用所致。

通過HER2+ HCC1954細胞和HER2- THP-1巨噬細胞的共培養(yǎng)進一步評估NJH395的藥效活性，NJH395或對照共孵育后評估上清液的IL1β分泌。與NJH397相比，當表達TLR7+ THP-1巨噬細胞和HER2+ HCC1954共培養(yǎng)時，NJH395誘導更多的IL1β分泌，MIW338和同型對照人IgG1處理組未檢測到IL1β，NJH395單獨與HCC1954腫瘤細胞孵育后不會誘導IL1β。 此外，MIM697誘導了THP-1巨噬細胞NF-kB的磷酸化。

NJH395的體內活性檢測。在N87和HCC1954腫瘤中，NJH395劑量≥3 mg/kg完全緩解。MIW338或NJH397沒有觀察到顯著抗腫瘤作用，這表明HER2靶向和TLR7激動作用有助于NJH395體內功效的發(fā)揮。與對照相比，NJH395在三種模型中均能顯著抑制腫瘤生長。

臨床前異種移植研究。在攜帶N87腫瘤的SCID小鼠中，單劑量靜脈注射NJH395與每周兩次腹膜內注射氯膦酸鹽脂質體同時進行，并與對照組（未經(jīng)治療或用單一給藥）進行比較。單獨用NJH395治療的小鼠在第28天的腫瘤明顯更小，單獨使用一或兩劑氯膦酸鹽脂質體后，Iba-1+巨噬細胞的腫瘤浸潤減少；但在NJH395治療后，即使聯(lián)合氯膦酸脂質體也增加。

NJH395毒理學研究。在食蟹猴中進行單劑量和重復劑量。經(jīng)NJH395治療的食蟹猴細胞因子增加，NJH395、NJH397和MIM697誘導高細胞因子表達，與人全血中的TLR7激動作用一致。臨床前PK數(shù)據(jù)表明，NJH395總ISAC（抗HER2抗體結合至少一種TLR7激動劑）和總抗體（抗HER2抗體結合或不含TLR7激動劑）的PK譜具有可比性。當單次靜脈推注劑量為30mg/kg時1只猴出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。NJH395會產生ADA（抗藥抗體）。

NJH395于2018年12月進行I期臨床試驗(NCT03696771)，用于非乳腺HER2+惡性腫瘤的治療。來自單次劑量遞增的18名患者的數(shù)據(jù)表明，TLR7激動劑在HER2+腫瘤細胞中誘導I型IFN反應，這與腫瘤微環(huán)境中的免疫調節(jié)相關，但其在耐受劑量下療效不足，客觀緩解率(ORR)為0%。NJH395誘導快速而強大的全身免疫激活，細胞因子釋放綜合征(55.6%, Gr≥2)是常見的藥物相關不良表現(xiàn)。高劑量給藥會產生ADA和神經(jīng)炎癥，作為第一個在人體中測試ISAC的臨床試驗，其結果不如人意。

除TLR受體激動劑構建的ISAC外，Sting激動劑構建的ISAC也前途坎坷。2023年3月13日，Mersana宣布其ISAC管線XMT-2056的Ⅰ期臨床試驗(NCT05514717)被FDA叫停。由Bolt Biotherapeutics開發(fā)BDC-1001于2023年9月22日獲得孤兒藥資格(Orphan Drug Designation)，其由Trastuzumab生物類似物與TLR7/8激動劑通過不可裂解連接子(聚乙二醇鏈)偶聯(lián)，但是，于2024年5月14日停止開發(fā)。

針對ISAC療效改善的可行性策略，可以考慮以下幾點：
1、優(yōu)化免疫刺激劑的選擇：選擇合適的免疫激動劑是ISAC研究和開發(fā)的主要挑戰(zhàn)之一。可以通過篩選具有更好療效和安全性的激動劑來提高ISAC的抗腫瘤功效。
2、調整藥物抗體比（DAR）：藥物抗體比是影響ISAC療效和毒性的重要因素。通過調整DAR值，可以改善ISAC的藥代動力學特性和減少副作用。
3、改進連接子設計：連接子的設計對于ISAC的穩(wěn)定性和有效載荷的釋放至關重要。開發(fā)新的連接子技術，如可切割或pH敏感的連接子，可能有助于在腫瘤微環(huán)境中更有效地釋放免疫刺激劑。
4、選擇低免疫原性的抗體：選擇免疫原性較低的單克隆抗體可以減少抗藥物抗體的產生，從而提高ISAC的療效和安全性。
5、瘤內給藥：考慮瘤內注射ISAC，以減少激動劑的全身滲漏，最大限度地減少脫靶毒性。然而，這種給藥方式面臨著技術挑戰(zhàn)，包括腫瘤的可及性和注射的均勻性。
6、聯(lián)合治療策略：將ISAC與其他免疫療法（如免疫檢查點抑制劑）或傳統(tǒng)化療、放療等方法聯(lián)合使用，可能有助于提高治療效果。
7、精準醫(yī)療：通過生物標志物的檢測，篩選出最有可能響應ISAC治療的患者群體，從而提高治療的精準性和效果。
8、結構優(yōu)化：通過對ISAC結構的進一步優(yōu)化，例如使用雙特異性抗體或改進有效載荷的化學結構，可能提高其在腫瘤微環(huán)境中的活性和選擇性。

ISAC的開發(fā)仍處于早期階段，盡管面臨挑戰(zhàn)，但通過不斷的研究和創(chuàng)新，ISAC有望成為一種有效的癌癥免疫療法

附：文章中提及的NF-kB的磷酸化檢測方法：使用Thunder技術進行檢測（KIT-NFKBP-100）。用MIM697處理1h，檢測THP-1細胞內的磷酸化NF-kB。使用TC處理的96孔板培養(yǎng)THP-1細胞，200ml培養(yǎng)基中加入125ng/mL PMA，37℃，5%二氧化碳孵育48h，生成貼壁細胞。去除培養(yǎng)基，用200 mL不含PMA的培養(yǎng)基替換，37℃，5%二氧化碳下靜置24小時。去除培養(yǎng)基，在細胞中加入50 mL的培養(yǎng)基。MIM697用培養(yǎng)基連續(xù)稀釋，在試驗孔中加入50 mL。在37℃，5%二氧化碳下孵育1h。按照貼壁細胞二板檢測方案進行檢測。裂解液轉移到384孔板，與檢測抗體在4℃下孵育過夜后進行檢測。
 

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