概述^[1]

核酸酶是一類能夠水解DNA與RNA等核酸分子的酶。根據(jù)底物偏好差異，核酸酶分為RNA核酸酶與DNA核酸酶。核酸酶在食品工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用，用于生產(chǎn)單核苷酸產(chǎn)品，以及去除蛋白，糖等生物制品中的核酸雜質(zhì)。絕大部分核酸酶為常溫核酸酶，在高溫容易失活，給生產(chǎn)運(yùn)輸帶來了不便，特別是不適合于高溫生產(chǎn)工藝。

非特異性核酸內(nèi)切酶是一類高活性的水解酶，其特點是能非特異性地降解幾乎所有形式的核酸。來自粘質(zhì)沙雷氏菌非特異性核酸內(nèi)切酶是其中的典型代表，該酶能降解各種形式核酸的核酸內(nèi)切酶，包括單鏈，雙鏈，線性和環(huán)狀DNA和RNA以及基因組DNA，對核酸的序列沒有嚴(yán)格要求，并且沒有蛋白酶活性。該酶在廣泛條件范圍具有很高的核酸降解活性，能將核酸完全消化成雜交限度以下的2-5個堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。

該酶由分子量為30kDa的兩個亞基組成，作用的pH范圍為6～10，溫度0～42℃，酶發(fā)揮活性需要1～2mM Mg2+。在離子型及非離子型表面活性劑和1mM PMSF，1mM EDTA，尿素存在下，核酸酶仍具有活性。大于150mM的單價陽離子，大于100mM的磷酸根，大于100mM硫酸銨和大于100mM鹽酸胍抑制酶的活性。

核酸酶具有廣闊的應(yīng)用前景，適合從生物制品中去除核酸，其主要應(yīng)用于以下幾個方面：

1、提高產(chǎn)品質(zhì)量：核酸酶通過降低生物制品，尤其是病毒類產(chǎn)品外源性核酸的含量，減少過敏反應(yīng)，提高制品安全性；

2、改善重組蛋白工藝：工程細(xì)胞裂解后加入核酸酶可降低料液的黏度，縮短處理時間，提高蛋白產(chǎn)量，離心時有利于沉淀和上清液的分離，超濾時有利于各成分的分離，提高柱層析純化時的有效性；

3、顆粒(病毒、包涵體等)預(yù)處理：有助于顆粒的純化；

4、生物分析樣品的處理：在ELISA、柱層析、二維電泳和印跡分析中，通過核酸酶的作用可提高分辨率和回收率。

制備^[2]

熱穩(wěn)定性核酸酶的制備：

步，設(shè)計合成嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶基因，并插入pET28表達(dá)載體，構(gòu)建熱穩(wěn)定性核酸酶的重組表達(dá)質(zhì)粒。重組嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶N端帶有來源于pET28載體的6個連續(xù)組氨酸親和純化標(biāo)簽，用于固定化鎳離子親和層析純化。

第二步，重組表達(dá)嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶。將嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3），得到嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶重組表達(dá)菌株。將表達(dá)菌株培養(yǎng)至OD600=0.6，加入0.5mM誘導(dǎo)劑IPTG，在16℃溫度下培養(yǎng)12小時，誘導(dǎo)嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶表達(dá)。

第三步，嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶親和純化。將步驟二誘導(dǎo)后的大腸桿菌離心收集后，菌體重新懸浮于蛋白裂解液（20mMTris-HCl,pH8.0,300mMNaCl,0.5mMDTT，10vol%甘油）。超聲波破碎菌體，加熱失活大腸桿菌雜質(zhì)蛋白，離心收集含有嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶的菌體裂解上清液。利用固定化鎳離子親和純化樹脂純化嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶。

第四步，檢測嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶的酶活性和酶活溫度依賴性。利用長度40個核苷酸的DNA與RNA分子作為底物，加入嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus熱穩(wěn)定性核酸酶，測定熱穩(wěn)定性核酸酶的酶活性溫度依賴性。測定結(jié)果表明嗜熱微生物Pyrococcusfuriosus編碼的熱穩(wěn)定性核酸酶在50-70度范圍內(nèi)具有最高的活性，同時該蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性。

固定化核酸酶制備：

30g殼聚糖溶解在600mL0.25mol/L的乙酸溶液中，室溫下劇烈攪拌4h，粘稠狀液體通過三層棉布過濾除去不溶性雜質(zhì)，然后逐漸滴加1mmol/L NaOH2L，堿性條件下(pH8.0～10.0)使殼聚糖沉淀，混合液在去離子水中透析3d，離心分離使絕大部分的殼聚糖沉淀下來，雙蒸水洗脫，真空冷凍干燥，在研缽中將其粉碎成粉末狀，備用。

取50ml核酸酶溶液，加入10g處理好的脫乙酰殼聚糖中，磁力攪拌30min，滴加一定濃度的戊二醛溶液60mL，恒溫攪拌一定時間，與4℃冰箱中交聯(lián)12h，最后用相應(yīng)pH值的緩沖溶液淋洗，抽干，即得固定化核酸酶。

主要參考資料

[1] 段昌群, 王煥校, & 曲仲湘. (1992). 重金屬對蠶豆(vicia faba)根尖的核酸含量及核酸酶活性影響的研究. 環(huán)境科學(xué)(5), 31-954.

[2] 陳潔, & 王璋. (2000). 麥芽根中核酸酶的提取及制備. 食品工業(yè)科技(1), 19-21.

[3] 王道苑, 張衛(wèi), & 許幗英. (1987). 黃芪多糖對核糖核酸酶及其抑制因子平衡系統(tǒng)的保護(hù)作用. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志(2), 93-96.