背景^[1-7]

酵母基因組DNA提取試劑盒采用DNA吸附柱和獨有的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來源的酵母培養(yǎng)物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR、酶切和雜交等實驗。

酵母細胞經(jīng)lyticase處理去除細胞壁后，獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

原理：采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶特異消化酵母細胞壁，能在1小時內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細胞壁后,然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點：1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。3.快速，簡捷，單個樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。

注意事項：1.樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的片段較小且提取量下降。2.若試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65度水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。3.洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應保存在-20℃，以防降解。

應用^[8][9]

酵母基因組DNA提取試劑盒可用于酵母基因組DNA提?。?/p>

在光滑球擬酵母基因組規(guī)模生物模型的構建與應用研究中以丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株Candida glabrata CCTCC M202019為研究模型,在完成全基因組測序、基因組功能注釋和比較基因組學研究的基礎上,構建了基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、轉錄調(diào)控網(wǎng)絡模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工業(yè)微生物輔因子代謝網(wǎng)絡模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。

結合上述基因組規(guī)模生物模型,運用基于約束的優(yōu)化算法,從基因、代謝、轉錄、輔因子等層面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高產(chǎn)、低致病性相關的生物安全性等),并發(fā)展了優(yōu)化其生產(chǎn)性能(如丙酮酸、富馬酸等丙酮酸去路中代謝物)的方法。

主要研究結果如下:1.運用二代高通量測序技術,對C.glabrata CCTCC M202019進行全基因組測序,其基因組特征包括:12.1 Mbp基因組大小、38.47%GC含量、5345個基因、191個t RNA、6個r RNA和1.15%的重復序列等。與C.glabrata CBS138進行比較基因組分析,發(fā)現(xiàn)雖然兩菌基因組具有高度相似性,但也存在差異如:中心碳代謝(營養(yǎng)物質(zhì)和二羧酸的轉運、氧化磷酸化和丙酮酸分解代謝)和黏附性代謝(凝集素蛋白的低復雜度重復區(qū)和功能結構域的缺失和變化)。

在此基礎上,借助在四種培養(yǎng)基上的丙酮酸發(fā)酵實驗、哥倫比亞血平板上生長實驗、96孔微孔板內(nèi)壁和內(nèi)皮細胞的黏附實驗,證明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更強的丙酮酸生產(chǎn)能力和更弱的黏附性和細胞毒性。2.根據(jù)C.glabrata氨基酸序列、文獻挖掘和專業(yè)數(shù)據(jù)庫,構建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804個基因、1025個代謝物和1287個生化反應,分布于細胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體、高爾基體、液泡和胞外區(qū)間。

參考文獻

[1]Using Genome-scale Models to Predict Biological Capabilities[J].Edward J.O’Brien,Jonathan M.Monk,Bernhard O.Palsson.Cell.2015(5)

[2]Inhibitors of amino acids biosynthesis as antifungal agents[J].Kamila Jastrz?bowska,Iwona Gabriel.Amino Acids.2015(2)

[3]Reconstruction and analysis of the genome-scale metabolic model of Lactobacillus casei LC2W[J].Nan Xu,Jie Liu,Lianzhong Ai,Liming Liu.Gene.2014

[4]Generation of an atlas for commodity chemical production in Escherichia coli and a novel pathway prediction algorithm,GEM-Path[J].Miguel A.Campodonico,Barbara A.Andrews,Juan A.Asenjo,Bernhard O.Palsson,Adam M.Feist.Metabolic Engineering.2014

[5]Effects of pyruvate dehydrogenase subunits overexpression on theα-ketoglutarate production in Yarrowia lipolytica WSH-Z06[J].Hongwei Guo,Catherine Madzak,Guocheng Du,Jingwen Zhou,Jian Chen.Applied Microbiology and Biotechnology.2014(16)

[6]Model based engineering of Pichia pastoris central metabolism enhances recombinant protein production[J].Justyna Nocon,Matthias G.Steiger,Martin Pfeffer,Seung Bum Sohn,Tae Yong Kim,Michael Maurer,Hannes Ru?mayer,Stefan Pflügl,Magnus Ask,Christina Haberhauer-Troyer,Karin Ortmayr,Stephan Hann,Gunda Koellensperger,Brigitte Gasser,Sang Yup Lee,Diethard Mattanovich.Metabolic Engineering.2014

[7]Metabolic model reconstruction and analysis of an artificial microbial ecosystem for vitamin C production[J].Chao Ye,Wei Zou,Nan Xu,Liming Liu.Journal of Biotechnology.2014

[8]Development of a minimal chemically defined medium for Ketogulonicigenium vulgare WSH001 based on its genome-scale metabolic model[J].Shicun Fan,Zhenyu Zhang,Wei Zou,Zheng Huang,Jie Liu,Liming Liu.Journal of Biotechnology.2014

[9]徐楠. 光滑球擬酵母基因組規(guī)模生物模型的構建與應用[D].江南大學,2017.