背景及概述^[1]

BCA法是理想的蛋白質(zhì)定量方法，在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。該測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)去垢劑等影響小。本試劑盒適用于微量蛋白質(zhì)濃度的測定。

產(chǎn)品規(guī)格^[1] 

溶液 A 100ml

溶液 B 100ml

溶液 C 5ml

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 20ml（2mg/ml）

產(chǎn)品保存^[1]

 室溫保存，一年有效。 

標(biāo)準(zhǔn)品以及工作液的制備^[1]

A. 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的制備

B. 微量BCA工作液的制備

1. 使用下列公式計(jì)算出所需工作液的總體積：

(標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù) +待測樣品孔數(shù)) × (重復(fù)數(shù)) × (每個(gè)樣品孔的工作液體積) = 所需工作液的總體積

例如: 標(biāo)準(zhǔn)的試管測定每個(gè)樣品需要3個(gè)不同的稀釋度和2次重復(fù)(8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔 + 3個(gè)待測樣品孔) × (2重復(fù)) × (1 ml) = 22 ml BCA工作液 (可以多配到25 ml)。

注意：在試管檢測法中，每個(gè)樣品需要1ml的工作液，在微孔板檢測中，每個(gè)樣品需要150μl的工作液。

2. 配制 BCA 工作液：

先將溶液 A、溶液 B 和溶液 C 按 50：48：2 的比例混合，所得溶液即 BCA 工作液。

比如：5 ml 溶液 A + 4.8 mL 溶液 B +200ul 溶液 C。

注意：試劑C剛加入到試劑A和試劑B中時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁并迅速消失呈清綠色溶液。制備足夠體積的工作液以檢測相應(yīng)數(shù)量的樣品。

使用方法^[1]

一：微孔板測定法

1. 吸取150ul的標(biāo)準(zhǔn)品及未知樣品分別至微孔板中。

2. 滴加150ul的工作液到每孔中并充分混合30秒。

3. 蓋上微孔板并在37°C孵育2小時(shí)或60℃放置 1 小時(shí)。

4. 微孔板冷卻至室溫。

5. 10分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀上測量562nm時(shí)的吸光值。注意：冷卻至室溫后依然會(huì)繼續(xù)顯色。但是，在室溫時(shí)的顯色比例已經(jīng)很低，在10分鐘內(nèi)檢測到的吸收值一般都不會(huì)有太大影響。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量樣品的濃度。

二：試管測定法

1. 吸取1.0ml的標(biāo)準(zhǔn)品及未知樣品分別至對(duì)應(yīng)標(biāo)記的檢測管中。

2. 滴加1.0ml的工作液至每管中并充分混合。

3. 蓋上檢測管并于60°C水浴孵育1個(gè)小時(shí)。

4. 所有試管冷卻至室溫。

5. 10分鐘內(nèi)在分光光度計(jì)上測量562nm時(shí)的吸光值。注意：冷卻至室溫后依然會(huì)繼續(xù)顯色。但是，在室溫時(shí)的顯色比例已經(jīng)很低，在10分鐘內(nèi)檢測到的吸收值一般都不會(huì)有太大影響。

6. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測量樣品的濃度。

主要參考資料

[1] 微量 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書