背景及概述^[1]

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)是根據(jù)目前世界上最常用的兩種蛋白濃度檢測(cè)方法之一BCA法研制而成，實(shí)現(xiàn)了蛋白濃度測(cè)定的簡(jiǎn)單、高穩(wěn)定性、高靈敏度和高兼容性。靈敏度高，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25μg/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5μg，待測(cè)樣品體積為1-20μl。在50-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

BCA法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響，需確保EDTA低于10mM，無(wú)EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。

使用說(shuō)明^[1]

1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

a.取1.2ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃長(zhǎng)期保存。

b.取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980μl稀釋液即可配制成0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20℃長(zhǎng)期保存。

2.BCA工作液配制

根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5mlBCA試劑A加100μl BCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.蛋白濃度測(cè)定

a.將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

b.加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl，需加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl。請(qǐng)注意記錄樣品體積。

c.各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30分鐘。

注: 也可以室溫放置2小時(shí)，或60℃放置30分鐘。BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

d.用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，或540-595nm之間的其他波長(zhǎng)的吸光度。

e.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

主要參考資料

[1] BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)