背景及概述^[1]

核酸外切酶一種要求有一個游離末端才能降解DNA或RNA的酶。5′-核酸外切酶需要有一個游離的5′端，從5′→3′的方向逐個降解核酸分子；3′-核酸外切酶則需要一個3′游離端，并按相反方向逐個降解核酸分子；而外切核酸酶Ⅲ(ExoⅢ)則是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)的一個多功能酶，使用最多的酶活性是3′→5′-核酸外切酶的活性，可在dsDNA中造成一個ssDNA區(qū)，故可用于Sanger的DNA序列分析法中。

T7核酸外切酶作用于雙鏈DNA，沿5→3方向催化去除5單核苷酸，它既能從5末端起始消化，也能從雙鏈DNA的切刻或缺口處起始消化。它既能降解5磷酸化DNA也能降解5去磷酸化DNA。據(jù)報(bào)道，它能沿5→3方向降解RNA/DNA雜交雙鏈上的RNA或DNA，但不能降解雙鏈或單鏈RNA。該酶是T7噬菌體基因6的產(chǎn)物。T7核酸外切酶具體有下列特點(diǎn)：1.5→3核酸外切酶活性2.切下DNA的5單核苷酸。T7核酸外切酶反應(yīng)條件：1XBuffer4[50mMKAc，20mMTris-Ac，10mMMg(Ac)2，1mMDTT(pH7.9@25℃)]，25℃溫育。

相關(guān)研究^[2]

有研究采用不依賴連接反應(yīng)的克隆法，利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆Notch2長片段基因。將難以擴(kuò)增的Notch2cDNA的編碼序列(7416bp)人為分成3段，引物設(shè)計(jì)時對此3個片段和載體骨架的引物進(jìn)行堿基硫代磷酸化修飾，用這些引物擴(kuò)增Notch2的3個片段和載體骨架。然后用T7核酸外切酶分別處理PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生4個具有3’互補(bǔ)突出末端的片段，并將此4個末端突出的片段退火復(fù)性，完成Notch2基因克隆。結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Notch23個片段和載體骨架的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符，經(jīng)退火復(fù)性獲得的克隆通過PCR、酶切和測序進(jìn)行克隆鑒定，確定Notch2編碼序列已經(jīng)插入到pcDNA3.0-3*Flag載體中。因此利用T7核酸外切酶和引物的堿基磷酸化修飾進(jìn)行的不依賴連接反應(yīng)的克隆方法能夠用于長片段基因的克隆。

主要參考資料

[1] 微生物學(xué)詞典

[2] 利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修飾引物克隆長片段基因的研究