背景^[1-6]

地高辛(DIG)原位雜交試劑盒是一款利用非放射標記物地高辛(DIG)的原位雜交試劑盒。地高辛標記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇物質(zhì)——Digoxigenin（DIG）。由于洋地黃植物的花和葉片Digoxigenin在自然界中的唯一來源，因此抗DIG的抗體不會與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標記的需要。

這一點，正是DIG勝于生物素(Biotin)的地方——同樣是小分子標記物，生物素廣泛存在于各種組織中，對于靈敏度很高的標記檢測實驗來說，樣品自身含有的內(nèi)源生物素，就會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。地高辛就能夠很好地避免這個問題。

DIG通過一個含有11個碳原子的空間臂與尿嘧啶核苷酸上的C5位置相連，一定濃度的DIG標記的核苷酸可以通過DNA polymerase(如E.coli DNA Polymerase,T4 DNA Polymerase,T7 DNA Polymerase,Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase）、RNA polymerase(如SP6,T3或T7 RNA Polymerase)或是末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal Transferase）的作用摻入到核苷酸探針中；也可通過隨即引物標記（random primed labeling）,缺口平移（nick translation），PCR，3’端標記/加尾或是體外轉(zhuǎn)錄制備帶有DIG標記的探針。當(dāng)然也可以通過化學(xué)合成的方法進行核苷酸的標記。

對于DIG標記探針的雜交檢測，可選用連接有堿性磷酸酶（alkaline phosphatase），過氧化物酶(peroxidase),熒光素（fluorescein）,若丹明（rhodamine）或是膠體金（colloidal gold）高親和性的抗DIG抗體共軛物；也可選用不帶任何共軛連接的抗DIG抗體和二級抗體。

檢測的靈敏度主要依賴于對不同抗DIG抗體共軛物顯示方法的選擇。以連接有堿性磷酸酶的抗DIG抗體為例：即可以使用NBT或BCIP做底物的顯色法，也可以使用HNPP熒光堿性磷酸酶底物，檢測的靈敏度常規(guī)可達到0.1pg(Souther blot)。所謂DNA探針，實質(zhì)上是一段已知的基因片段，應(yīng)用這一基因片段即可與待測樣品雜交。

如果靶基因和探針的核苷酸序列相同，就可按堿基配對原則進行核酸分子雜交，從而達到檢查樣品基因的目的。在隨機引物法標記反應(yīng)液中，有隨機合成的六聚體核昔酸(hexanucleotide)作為引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作為合成底物，以單鏈DNA作為模板，在Klenow酶的作用下，合成摻入地高辛的DNA鏈。以地高辛標記的探針與靶基因DNA鏈雜交后，再通過免疫反應(yīng)來進行檢測。一般通過酶標抗地高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應(yīng)的存在。免疫檢測一般用堿性磷酸酶系統(tǒng)，BC1P/NBT顯色。敏感性很高?？捎糜谀ど想s交和原位雜交。

地高辛(DIG)原位雜交試劑盒特點：

（1）標記屬高效標記反應(yīng)。以1μgDNA探針為例，1小時反應(yīng)即可產(chǎn)生0.8μg標記探針，20小時可產(chǎn)生2μg左右的標記探針。

（2）試劑將標記反應(yīng)所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow酶等混合在一起。一次標記只需吸取一次標記液，使用至為簡便。

（3）標記反應(yīng)適于下述對象：a.DNA從10ng—3μg。b.不等的DNA長度100bp—10kb。c.線形排列或呈高度卷曲之DNA。d.低融點瓊脂中的DNA。

（4）檢測系統(tǒng)抗體為抗地高辛單抗，標記堿性磷酸酶。效價1：5000（膜上雜交）或1：500（原位雜交）。

（5）顯色劑為BCIP/NBT，兩種成分混合后保存于67%DMF中，非常穩(wěn)定。用時1：50稀釋。

（6）試劑盒敏感性達到0.1pg，足夠檢測出1μg基因組DNA中的單個基因。

（7）除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。

應(yīng)用^[7]

地高辛(DIG)原位雜交試劑盒可用于DNA 探針的隨機引物標記及各種膜上雜交和原位雜交。

例如在地高辛標記探針原位雜交檢測豬延髓TPH2 mRNA的表達的研究中采用PCR法對豬TPH2 cDNA探針進行地高辛(digoxigenin,DIG)標記,應(yīng)用核酸分子原位雜交技術(shù)檢測豬延髓組織內(nèi)TPH2 mRNA的表達。結(jié)果表明:地高辛標記的TPH2cDNA探針使用簡便,靈敏度高,特異性強,雜交結(jié)果直觀,探針保存時間較長,無放射性污染;豬延髓組織內(nèi)的血管壁、蛛網(wǎng)膜、下橄欖核區(qū)與極后區(qū)的神經(jīng)元均有陽性反應(yīng),TPH2 mRNA的表達較高,提示了TPH2在這些部位的存在與5-HT的轉(zhuǎn)運具有相關(guān)性。

參考文獻

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