背景[1-7]
熒光原位雜交(FISH)試劑盒原理是將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理是，按照兩個核酸的堿基序列互補原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定量。
熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟：
1. 玻片處理
2. 樣品制備及其所涉及的試劑包括
3. 取樣及保存方法
4. 樣品固定
5. 樣品雜交
6. DAPI染色
7. 封片熒光顯微鏡進(jìn)行檢測
FISH實驗關(guān)鍵因素：
1.溫度
FISH實驗溫度直接影響探針雜交效率，實驗中要求對相關(guān)儀器溫度溫差小于0.5℃，且實驗環(huán)境溫度要求20℃以上，一次實驗操作不宜超過四張玻片，盡量保證實驗溫度一致。
2.濕度
FISH實驗中適度同樣直接影響雜交效率，尤其預(yù)雜交，雜交過程中需在濕盒中加入預(yù)雜交液/雜交液以保持環(huán)境濕度。
3.光照
FISH探針標(biāo)記有熒光染料，光照影響熒光染料強度，實驗過程中應(yīng)注意避光，實驗完成后盡快滴加熒光保護(hù)劑封片，并避光保存。
4.PH值
FISH實驗對各試劑pH值要求嚴(yán)格，試劑pH值直接影響實驗穩(wěn)定性，每次實驗試劑都需現(xiàn)用現(xiàn)配，精確調(diào)節(jié)pH值，且實驗用水使用滅菌去離子水。
FISH技術(shù)優(yōu)勢：操作簡單、檢測快速、結(jié)果易觀察、可檢測多種類樣品、空間定位準(zhǔn)確、靈敏性和特異性高。
應(yīng)用[8]
FISH臨床意義有指導(dǎo)臨床治療及藥物選擇、疾病的分期分型及預(yù)后判斷、形態(tài)學(xué)檢測的輔助手段。
例如在FISH技術(shù)在骨髓增生異常綜合征中的應(yīng)用與PRAME基因在骨髓增生異常綜合征表達(dá)的研究中對MDS患者進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯帶分析(CC)和FISH檢測,建立在MDS診斷過程中的規(guī)范化的FISH檢測平臺；比較FISH與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法在檢測MDS染色體異?？寺≈械牟町?探討FISH在MDS診斷中的地位。同常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯帶分析(CC)不同,熒光原位雜交技術(shù)(FISH)不需要細(xì)胞培養(yǎng),利用位點特異性基因探針可以檢測間期細(xì)胞的克隆性染色體改變,并可以檢測出10-20%左右核型正常的MDS的異?？寺?。應(yīng)用FISH技術(shù),可以提高M(jìn)DS患者染色體異常檢出率,為診斷和治療提供幫助。
參考文獻(xiàn)
[1]Idiopathic cytopenia of undetermined significance and the minimal criteria for a diagnosis of myelodysplastic syndrome[J].Jiri Pavlu,Julie Emmerson,Alexandra J.Marks,Barbara J.Bain.Leukemia&Lymphoma.2011(3)
[2]ASXL1 mutation is associated with poor prognosis and acute transformation in chronic myelomonocytic leukaemia[J].British Journal of Haematology.2010(4)
[3]Cause of death in patients with lower‐risk myelodysplastic syndrome[J].FarshidDayyani,Anthony P.Conley,Sara S.Strom,WilliamStevenson,Jorge E.Cortes,GautamBorthakur,StefanFaderl,SusanO’Brien,SherryPierce,HagopKantarjian,GuillermoGarcia‐Manero.Cancer.2010(9)
[4]Efficacy of azacitidine compared with that of conventional care regimens in the treatment of higher-risk myelodysplastic syndromes:a randomised,open-label,phase III study[J].Pierre Fenaux,Ghulam J Mufti,Eva Hellstrom-Lindberg,Valeria Santini,Carlo Finelli,Aristoteles Giagounidis,Robert Schoch,Norbert Gattermann,Guillermo Sanz,Alan List,Steven D Gore,John F Seymour,John M Bennett,John Byrd,Jay Backstrom,Linda Zimmerman,David McKenzie,CL Beach,Lewis R Silverman.Lancet Oncology.2009(3)
[5]Clofarabine induces hypomethylation of DNA and expression of Cancer-Testis antigens[J].Yana Zhang,Masum Shahriar,Jian Zhang,Sharif Uddin Ahmed,Seah H.Lim.Leukemia Research.2009(12)
[6]Comorbidities and survival in a large cohort of patients with newly diagnosed myelodysplastic syndromes[J].Rong Wang,Cary P.Gross,Stephanie Halene,Xiaomei Ma.Leukemia Research.2009(12)
[7]Update on genetic and molecular markers associated with myelodysplastic syndromes[J].Peter Valent,Rotraud Wieser.Leukemia&Lymphoma.2009(3)
[8]叢佳.FISH技術(shù)在骨髓增生異常綜合征中的應(yīng)用與PRAME基因在骨髓增生異常綜合征的表達(dá)[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2012.