背景[1-3]
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit)是一種用于從細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)的實驗工具。它可以分別提取細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中的蛋白質(zhì)，以便進一步研究這些蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和相互作用等。
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒通常包含以下成分：
1.磷酸緩沖液：用于調(diào)節(jié)pH值，保證提取過程的穩(wěn)定性。
2.氯化銨：用于沉淀細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)。
3.乙酸鹽：用于改變細(xì)胞漿中的pH值，使蛋白質(zhì)沉淀到溶液底部。
4.硫酸鈉：用于稀釋樣品，提高提取效率。
使用該試劑盒時，需要先將待提取的細(xì)胞或組織進行固定、包埋或切片等處理，然后將其加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的試劑盒中，按照說明書上的步驟進行操作。通常情況下，提取后的蛋白質(zhì)會在不同的離心管中分離出來，需要根據(jù)需要進行進一步的純化和檢測。
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒的操作步驟：
1.將待提取的組織或細(xì)胞放入冰浴中，以保持其低溫狀態(tài)。
2.在離心管中加入適量的磷酸緩沖液和氯化銨，使其成為懸濁液。將待提取的組織或細(xì)胞懸浮在懸濁液中。
3.將離心管置于高速離心機中，進行離心處理。離心時間通常為5-10分鐘，具體時間取決于樣品的性質(zhì)和離心機的型號。離心后，上清液會轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。
4.加入適量的乙酸鹽和硫酸鈉，使懸濁液中的蛋白質(zhì)沉淀到溶液底部。然后用吸球或移液器將沉淀物轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。
5.在新的離心管中，加入等量的磷酸緩沖液和氯化銨，再次進行離心處理。離心后，上清液會轉(zhuǎn)移到另一個離心管中。重復(fù)此步驟2-3次，以獲得更純凈的細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白提取物。
6.最后，可以使用電泳或其他蛋白質(zhì)分離技術(shù)對提取物進行進一步分析和檢測。
需要注意的是，在使用該試劑盒時，應(yīng)根據(jù)實驗需要選擇適當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E和條件，并嚴(yán)格遵守說明書上的操作要求。同時，應(yīng)注意避免過度濃縮樣品，以免影響蛋白質(zhì)的質(zhì)量和純度。
使用細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒時需要注意以下事項：
1.操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，了解試劑盒的使用方法、條件和注意事項。
2.在操作過程中，應(yīng)注意保持實驗環(huán)境的清潔和衛(wèi)生，避免污染樣品。
3.在加入試劑時，應(yīng)注意避免過量或不足。特別是在添加氯化銨和乙酸鹽時，應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)和離心機的型號進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
4.在離心過程中，應(yīng)注意控制離心速度和時間，以避免樣品過度濃縮或沉淀不完全。
5.在分離蛋白質(zhì)時，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)碾娪緱l件和緩沖液，以保證蛋白質(zhì)的質(zhì)量和純度。
6.在處理樣品時，應(yīng)注意避免對細(xì)胞或組織造成損傷或破壞。
7.在操作完成后，應(yīng)及時清洗和消毒實驗器材和容器，以避免交叉污染。
應(yīng)用[4-5]
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒可以用于LIPUS聯(lián)合靶向納泡促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用及其機制研究
細(xì)胞骨架微絲在LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化過程中的作用目的:觀察LIPUS聯(lián)合cRGD-NBs作用后細(xì)胞骨架微絲的變化以及干擾細(xì)胞骨架微絲對于LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化能力的影響。
方法:將BMSCs分為四組(Control組,cRGD-NBs組,LIPUS組,LIPUS+cRGD-NBs組),各組處理后0 h、0.5 h、2 h和4 h進行微絲綠色熒光探針染色,于共聚焦顯微鏡下觀察各組微絲形態(tài)及熒光強度;通過WB檢測胞內(nèi)纖維狀肌動蛋白(Filamentous actin,Factin)與球狀肌動蛋白(Globular actin,G-actin)的蛋白表達情況。隨后將細(xì)胞分為四組:Control組,二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)組,Jasplakinolide(JA)組,細(xì)胞松弛素D(Cytochalasin D,Cyto D)組,每組皆進行LIPUS/cRGD-NBs處理。
WB檢測各組胞內(nèi)F-actin與G-actin蛋白表達;ALP染色評估各組早期成骨分化差異以及WB分析成骨相關(guān)指標(biāo)(RUNX2、OPN、OCN)和TRPM7的蛋白表達;免疫熒光染色觀察各組RUNX2蛋白表達。結(jié)果:與Control組相比,LIPUS處理后2h胞內(nèi)綠色點狀物質(zhì)明顯增多且聚集于核周圍,絲狀F-actin數(shù)量明顯減少;4 h后,絲狀Factin數(shù)量明顯增加且熒光強度增強,但胞內(nèi)仍有少量斑點。而與LIPUS組相比,LIPUS+cRGD-NBs組在各個時間點熒光強度均增強且絲狀物質(zhì)表現(xiàn)更為明顯(特別是在4h)。
通過評估各組上述時間點的F-actin/G-actin蛋白表達比值發(fā)現(xiàn),與Control組相比,LIPUS組的比值在0 h無明顯變化,0.5 h后下降,2h后降低更為明顯,4h后顯著升高;而與LIPUS組相比,LIPUS+cRGD-NBs組各個時間點均表現(xiàn)為比值升高(特別是在4h)。細(xì)胞骨架干擾藥物JA(肌動蛋白聚合劑)或Cyto D(肌動蛋白解聚劑)作用后,與DMSO組相比,Factin/G-actin比值分別表現(xiàn)為顯著的上升和下降;JA組ALP陽性染色以及成骨相關(guān)指標(biāo)(RUNX2、OPN、OCN)和TRPM7的蛋白表達均明顯增加,而Cyto D組則顯著降低,皆與DMSO組相比。
免疫熒光分析各組RUNX2蛋白表達發(fā)現(xiàn)與WB呈相同的趨勢。結(jié)論:LIPUS促BMSCs成骨分化過程中,微絲經(jīng)歷了短暫的解聚和重排后又表現(xiàn)為聚合增加;在LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化過程中微絲聚合進一步增強;而促進微絲的聚合能提升LIPUS/cRGD-NBs的促成骨分化能力。
結(jié)論:LIPUS/cRGD-NBs促成骨分化過程中TGFβ1表達上調(diào);過表達TGFβ1可能提升LIPUS/cRGD-NBs作用下的成骨分化效應(yīng);上調(diào)TGFβ1可能協(xié)同BMP9誘導(dǎo)的成骨分化效應(yīng)。
參考文獻
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