背景技術(shù)
人血白蛋白（human serum albumin，HSA)是一種小分子量、非糖基化、帶負(fù)電荷的 血清蛋白，具有物質(zhì)結(jié)合、運(yùn)輸、抗氧化以及酶活性等多種功能。生理情況下，白蛋白是 細(xì)胞外液中含量最多的蛋白質(zhì)，其中血漿白蛋白含量為35~50g/L，約占血漿總蛋白的60%， 遠(yuǎn)高于組織間液中的蛋白含量。白蛋白主要在肝臟合成，但不在肝臟內(nèi)貯存，由肝細(xì)胞直接 分泌到竇狀隙中進(jìn)入血液循環(huán)，半衰期為17~19d，最終由肌肉、肝臟和腎臟等降解。
HSA是一種包含有585個(gè)氨基酸的小分子球狀蛋白質(zhì)，有少量色氨酸和蛋氨酸殘基 及大量的帶電荷的賴氨酸、天門冬氨酸殘基，沒(méi)有非朊基團(tuán)和糖，分子量為eekDd線晶體照 相顯示其擁有一個(gè)心形的三維結(jié)構(gòu)，但在溶液中呈橢圓體。HSA由3個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域(I 一 m) 組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)亞級(jí)結(jié)構(gòu)(A和B)，分別由4個(gè)和6個(gè)α螺旋組成，結(jié)構(gòu)域間的二硫鍵 和亞級(jí)結(jié)構(gòu)間通過(guò)脯氨酸殘基提供的靈活環(huán)結(jié)構(gòu)做相對(duì)移動(dòng)以助于白蛋白結(jié)合各種物質(zhì)。 生理情況下，HSA主要以帶一個(gè)自由硫氫基的還原形式存在(HSA-SH)，也稱硫基白蛋白。半 胱氨酸-34的硫氫基部分有助于硫醇化作用和亞硝基化進(jìn)程，這與HSA在體內(nèi)的多種作用有 關(guān)。小部分HSA以二硫化物形式存在，且含量隨年齡增長(zhǎng)而增高，在氧化應(yīng)激等疾病狀態(tài)時(shí) 也會(huì)增高。
HSA可結(jié)合多種內(nèi)源性和外源性化合物，包括脂肪酸、金屬離子、藥物、代謝產(chǎn)物 等，提示其具有藥物轉(zhuǎn)運(yùn)功能。HSA結(jié)合位點(diǎn)I和Π 位于不同的結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)結(jié)合與蛋白質(zhì)作 用的大多數(shù)藥物，其中位點(diǎn)I除了可結(jié)合較大的雜環(huán)化合物或二羧基酸，以及其他多種化合 物外，還可以結(jié)合體積龐大的內(nèi)源性物質(zhì)，如膽紅素、撲啉等，位點(diǎn)Π 則較小且欠靈活，結(jié)合 功能更為特異。半胱氨酸-34可結(jié)合順鉑、青霉胺、Ν-乙酰半胱氨酸等藥物。一氧化氮(Ν0)也 可通過(guò)親電子與半胱氨酸-34結(jié)合形成S-亞硝基白蛋白，產(chǎn)生擴(kuò)血管作用，但生理狀況下， 血漿中S-亞硝基白蛋白含量極低（〈10 nmol/L)，目前還不清楚病理狀況下HSA能在多大程 度上結(jié)合N0及其衍生物。此外，還有一些藥物和化合物不能確定具體的結(jié)合位點(diǎn)。
HSA具有協(xié)調(diào)維持血管內(nèi)皮完整性，抗氧化作用，臟器功能保護(hù)，維持膠體滲透壓， HSA還有保護(hù)血細(xì)胞、調(diào)節(jié)凝血、作為氮源為損傷組織修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)等作用。因此，開(kāi)發(fā)檢測(cè) 迅速，操作簡(jiǎn)單，成本低廉的HSA檢測(cè)方法具有重要意義。
本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白含量的方法及應(yīng)用，具體為HCAB可 與白蛋白特異性結(jié)合，抑制了扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，非輻射躍迀減少，從而恢復(fù)熒光， 實(shí)現(xiàn)白蛋白的定量檢測(cè)。在生理pH值條件下被激發(fā)后(激發(fā)波長(zhǎng)λ Μ= 424 nm)產(chǎn)生穩(wěn)定的 熒光信號(hào)(發(fā)射波長(zhǎng)λ_= 560 nm)。其熒光值強(qiáng)度與白蛋白的濃度成正比，根據(jù)檢測(cè)到的熒 光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測(cè)定血漿、尿液等多種生物樣品中 白蛋白的絕對(duì)含量，同時(shí)還具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)、易于高通量檢測(cè) 的優(yōu)勢(shì)，并且操作簡(jiǎn)單，成本低廉。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
探針1、2或HCAB的合成
探針1的合成： 1 · 3mmol的化合物3 (2 ' -羥基苯乙酮）、1 · 2mmol的化合物4(4-二甲氨基苯甲醛)溶解在 30mL乙醇中，再向其中滴加4.9mmol氫氧化鉀溶液。攪拌8 h，旋蒸除去溶劑，將剩余固體純 化(硅膠、乙酸乙酯-正己烷作為洗脫劑，1: 5，v/v)，得到紅色固體160mg，為探針1，產(chǎn)率為 50%。探針 1 的 1HNMR (400 MHz,CDC13): δ 13.19 (s，1H)，7.91 (d，J = 7.0 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.37-7.49 (m, 2H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.96 (m, 1H), 6.69 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.05 (s, 6H)。
探針HCAB的合成： 將0 · 5mmol的探針1和0 · 5mmol的三乙胺加入到10mL的四氫呋喃中，再將苯甲酰氯(0.6 mmol，混合5mL四氫呋喃)在30分鐘內(nèi)逐滴加入反應(yīng)混合物中，在0°C下攪拌lh，然后升溫至 室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。旋蒸除去溶劑，剩余固體純化(硅膠、乙酸乙酯-正己烷作為洗脫劑，l:3，v/ v)，得到103 mg的黃色固體，為探針HCAB，產(chǎn)率為55%。探針HCAB的1H NMR (400 MHz, CDC13)： δ 8.13 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.54 (m, 3H), 7.35 (m, 6H), 6.94 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.58-6.60 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 3.01 (s, 6H); 13CNMR (100 MHz, CDCI3): 191.84， 165.02， 152.06， 148.63， 146.91， 133.51, 133.42, 131.65, 130.42, 130.31, 129.80, 129.29, 128.49, 125.95, 123.40, 122.25, 120.71, 111.71, 40.99; HRMS: m/z calcd for C24H21NO3： 371.1521 and found 371.1522。
探針2的合成： 將0.5mmol的探針1和0.5mmol的三乙胺加入到10mL的四氫呋喃中，再將乙酰氯（0.6 mmol，混合5mL四氫呋喃)在30分鐘內(nèi)逐滴加入反應(yīng)混合物中，在0°C下攪拌lh，然后升溫至 室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。旋蒸除去溶劑，剩余固體純化(硅膠、乙酸乙酯-正己烷作為洗脫劑，1:3，v/ v)，得到82mg的黃色固體為探針2,產(chǎn)率為53%。探針2的1H NMR (400 MHz, CDCI3): δ 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42-7.56 (m,4H), 7.32 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.03 (s, 6H), 2.22 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCh): 191.85，169.44， 152.15, 148.48, 146.74, 133.16, 130.45, 131.73, 129.74, 125.93, 123.33, 122.20, 120.39, 111.83, 40.10, 21.01. HRMS: m/z calcd for C19H19NO3： 309.1365 and found 309.1372。