背景及概述

河豚的魚肉鮮嫩味美，帶有肉刺的魚皮，膠質(zhì)濃厚，食之黏口，味覺美感遠(yuǎn)勝于魚翅、海參，因此被譽(yù)為“長(zhǎng)江三鮮”之首。但河豚大都含有河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)，毒素集中于卵巢、肝臟、腎臟、血液、眼睛、魚鰓及皮膚中。河豚毒素比較穩(wěn)定，用鹽腌、日曬、一般加熱燒煮等方法都不易消除。1990年我國(guó)出臺(tái)的《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》明文規(guī)定：河豚魚有劇毒，不得流入市場(chǎng)。河豚毒素是一種弱堿性動(dòng)物生物堿，為非蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素。

河豚毒素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

河豚毒素的化學(xué)研究始于1909年，1964年以后由Woodward測(cè)定了TTX的結(jié)構(gòu)，1972年Kishi等采用化學(xué)方法成功合成了河豚毒素。河豚毒素分子式為C11H17N3O8，分子量為319.27。分子主要由3個(gè)氮原子組成，它們與氫氧原子形成特殊的結(jié)構(gòu)。含有1個(gè)碳環(huán)，1個(gè)胍基，6個(gè)羥基，在C-5和C-10位有一個(gè)半醛糖內(nèi)酯連接著分開的環(huán)。有專家將其稱為“自然界最奇特的分子之一”，也是世界上最致命的毒藥之一。1g河豚毒素的毒性是1g氰化物的1萬(wàn)倍。TTX粗制品為棕黃色粉末，純品為無色晶體，呈針狀或菱形，無臭，無味，易吸濕潮解，不溶于無水乙醇、乙醚、苯等有機(jī)溶劑，微溶于水，極易溶于稀酸水溶液。TTX在溶液中存在TTX、半縮醛型TTX、內(nèi)酯型TTX動(dòng)態(tài)平衡的三種結(jié)構(gòu)。TTX理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，在中性和酸性條件下對(duì)熱穩(wěn)定，240℃開始碳化，但300℃以上也不分解。在堿水溶液中易分解，在5%氫氧化鉀溶液中于80℃～100℃可分解成黃色結(jié)晶2-氨基-6-羥甲基-8-羥基-喹唑啉，這也是TTX化學(xué)檢測(cè)法的理論基礎(chǔ)。

河豚毒素的來源

河豚毒素可從多種動(dòng)物中檢測(cè)得到，并非河豚所特有的。那究竟河豚毒素從何而來?目前主要有內(nèi)因說和外因說兩種。Matsumura[4]等用授精法從河豚魚卵母細(xì)胞發(fā)育的胚胎中發(fā)現(xiàn)河豚毒素的毒性隨胚胎發(fā)育不斷增高，提出TTX是河豚魚胚胎的產(chǎn)物，但沒有更多證據(jù)證實(shí)這種說法。外因說即所謂的食物鏈假說和微生物起源假說。YujiNagashima[5]等通過用不同的豚魚肝臟切片進(jìn)行試驗(yàn)。肝臟切片在河豚毒素濃度為25μg/mL的培養(yǎng)基中孵育，檢測(cè)河豚毒素的積累表明了在河豚魚和豚魚肝臟間河豚毒素的累積是不同的，它們的不同并不在于河豚毒素的分泌能力，而在于它的吸收能力。河豚毒素的體外積累實(shí)驗(yàn)支持了外因說這一觀點(diǎn)。雖然河豚毒素的起源問題一直存在爭(zhēng)議，目前為止研究人員并沒有在河豚魚體內(nèi)找到可分泌毒素的腺體和導(dǎo)管，但已從海洋細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)得到河豚毒素及其類似物。認(rèn)為河豚毒素來源于攝食。研究人員認(rèn)為食物鏈?zhǔn)呛与喽舅氐闹饕e累途徑。為了證明它的起源，研究了幾種耐河豚毒素的生物體，從中分離出幾種腸道細(xì)菌，并證明某些腸道細(xì)菌確實(shí)能產(chǎn)河豚毒素，推斷海洋中河豚毒素的最初生產(chǎn)者是這些海洋細(xì)菌。此外，通過浮游動(dòng)物經(jīng)食物鏈傳遞、或寄生(共生)等途徑來積累河豚毒素的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了遵循食物鏈中越高級(jí)的生物有著越高濃度的河豚毒素的原則。這個(gè)假說也通過用非毒性河豚魚由于喂養(yǎng)含河豚毒素的飼料而中毒的事實(shí)得到證明。

河豚毒素的作用機(jī)制

1982年，美國(guó)植物學(xué)家韋德-戴維斯發(fā)現(xiàn)，海地巫毒教中的回魂大師在藥物中使用含有從河豚提取的毒素粉末，整個(gè)過程里中毒者大腦能完全保持清醒，如果能挺過24h，他們就會(huì)很快恢復(fù)正常，且不會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥。使人們相信他們有使人“死而后生”的能力，即所謂的“還魂術(shù)”。其實(shí)，這是由于河豚毒素的特殊結(jié)構(gòu)使其像塞子一樣，凝固在神經(jīng)軸突的鈉離子通道的入口處，阻礙鈉離子透過細(xì)胞膜傳導(dǎo)神經(jīng)的沖動(dòng)，從而關(guān)閉神經(jīng)系統(tǒng)。由于河豚毒素不能越過大腦中血液細(xì)胞的屏障，因此受害者就會(huì)處于大腦清醒的無助狀態(tài)之中。幾小時(shí)或幾天過后，當(dāng)河豚毒素最終開放鈉離子通道時(shí)大多數(shù)受害者已經(jīng)死亡。TTX是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴性鈉離子通道，從而阻滯動(dòng)物電位，抑制神經(jīng)肌肉間興奮的傳導(dǎo)，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理機(jī)能的障礙，主要造成肌肉和神經(jīng)的麻痹。構(gòu)效關(guān)系表明，TTX的活性基團(tuán)是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羥基，胍基在生理pH值下發(fā)生質(zhì)子化，形成正電活性區(qū)域與鈉離子通道受體蛋白的負(fù)電性羰基相互作用，從而阻礙離子進(jìn)入通道。河豚毒素能夠麻痹人的肌肉和神經(jīng)，而對(duì)河豚魚自身沒有影響。日本專家認(rèn)為，這是因?yàn)楹与嗉∪饧?xì)胞的結(jié)構(gòu)和人的不同，研究人員對(duì)河豚肌肉表面收容體的遺傳基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中氨基酸的種類和人類的不同，河豚的這些氨基酸不與河豚毒素結(jié)合。除此以外，研究人員還發(fā)現(xiàn)河豚血液中有可以中和河豚毒素的蛋白質(zhì)。

河豚毒素的提取

TTX的提取方法主要有乙酸提取或改良乙酸提取、樹脂提取和甲醇提取等。目前，我國(guó)TTX提取常用的方法是從河豚魚體不同部位提取純化TTX，一般工藝流程為[1]：河豚魚→水，乙酸等浸提→除蛋白質(zhì)、脂類→離子交換等方法分離→脫色→活性炭吸附、聚丙烯酰胺層析等方法純化→濃縮、精制→結(jié)晶，此法TTX的提純難達(dá)到試劑級(jí)的高精水平。由于很多文獻(xiàn)報(bào)道TTX多克隆抗體能夠與TTX特異性結(jié)合，中和其毒性，因此可以考慮將TTX多克隆抗偶聯(lián)于載體制成免疫親和層析介質(zhì)，再對(duì)TTX進(jìn)行純化，簡(jiǎn)化其提取工藝，提高TTX產(chǎn)率。由于大量捕殺河豚魚受到資源和時(shí)空的限制，破壞了河豚魚資源，甚至導(dǎo)致生態(tài)平衡的破壞，所以人們不得不另辟蹊徑。根據(jù)河豚毒素的微生物起源，分離出產(chǎn)河豚毒素的微生物類群，通過微生物發(fā)酵來產(chǎn)生河豚毒素。產(chǎn)TTX的微生物類群有弧菌屬(Vibrio)的溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，希瓦氏菌屬的腐敗希瓦菌芽孢桿菌屬(Bacillus)，鏈霉菌屬(Streptomyces)，其中產(chǎn)毒力較高的主要是溶藻弧菌和河豚毒素互生單胞菌(Alteromonastetrodonis)[8]。但微生物產(chǎn)河豚毒素產(chǎn)量非常低，僅為ng級(jí)。由于其產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，提高其產(chǎn)量及其純化方法也是一個(gè)難題。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭慧清, 劉渝洲, 王紅雨, 等 . 聯(lián)合采用吸附樹脂與離子交換樹脂提取河豚毒素 [J]. 廣州師院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1997 , 2:60- 63