背景[1-3]
LNCAP細(xì)胞于1977年從一名50歲的明確診斷為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的白人男性患者的左鎖骨上淋巴結(jié)細(xì)針穿刺的活體組織中分離建立的。5-α-雙氫睪酮可影響該細(xì)胞的生長(zhǎng)和酸性磷酸酶的產(chǎn)生。
該細(xì)胞不形成均一的單層而是成簇生長(zhǎng)，所以傳代的時(shí)候要反復(fù)吹打形成單個(gè)細(xì)胞；該細(xì)胞貼壁不牢，達(dá)不到匯合狀態(tài)，而且會(huì)使培養(yǎng)基迅速變酸；傳代后48h內(nèi)一定要保持培養(yǎng)瓶靜止。如果此時(shí)挪動(dòng)培養(yǎng)瓶，會(huì)使大部分細(xì)胞從瓶底脫落。如果出現(xiàn)此種情況，需要重新孵育24~48h使細(xì)胞重新貼壁，細(xì)胞貼壁后可更換培養(yǎng)基。
LNCAP細(xì)胞
當(dāng)培養(yǎng)瓶封包后，多數(shù)LNCaP clone FGC細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底分離，懸浮在培養(yǎng)基中。收到后，在通常培養(yǎng)單層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，以使細(xì)胞再貼壁。此后，可以換上新鮮培養(yǎng)液。如果需要，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物可以收集，300g離心15分鐘，以10毫升培養(yǎng)液重懸并培養(yǎng)到一個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)瓶中。
細(xì)胞傳代流程：
（1）吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加2-3ml0.25%胰酶進(jìn)行消化細(xì)胞（注意把握消化時(shí)間，通?？刂圃?-2min）
（2）注意培養(yǎng)基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存
（3）取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿/瓶中，添加適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基，把細(xì)胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
（4）鏡下觀察消化情況，在HS505.T人淋巴結(jié)成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)特性邊緣縮小，貼壁松動(dòng)時(shí)（不建議消化到細(xì)胞漂?。┤サ粢让?，加6-8ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞層，盡量把細(xì)胞層吹落，吹散。
應(yīng)用[4][5]
用于柴胡皂苷d誘導(dǎo)前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡及自噬的研究
通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究柴胡皂苷d對(duì)前列腺癌LNCap細(xì)胞凋亡及自噬的影響,以期為臨床治療提供參考依據(jù)。
方法:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTS法檢測(cè)SSd對(duì)人前列腺癌LNCap細(xì)胞活力的影響;通過(guò)Hoechst 33258熒光染色、Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,用Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。
此外,通過(guò)免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)以及Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62的表達(dá),探討SSd對(duì)LNCap細(xì)胞自噬的影響,同時(shí)研究自噬抑制劑和自噬激活劑對(duì)該過(guò)程的影響。
結(jié)果:1.MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力:不同濃度的SSd（0、2.5、5、10、20μmol/L）分別處理LNCap細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,結(jié)果顯示SSd能抑制LNCap細(xì)胞增殖,與對(duì)照組相比,隨著給藥濃度的增加,細(xì)胞活力下降;同一給藥濃度,隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活力下降,說(shuō)明SSd對(duì)LNCap細(xì)胞增殖的抑制作用表現(xiàn)為一定的時(shí)間依賴性和濃度依賴性。
2. Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化:對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則,呈現(xiàn)出彌散均勻的藍(lán)色熒光,隨著給藥濃度的增加,不規(guī)則核細(xì)胞數(shù)逐漸增加,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光,當(dāng)給藥濃度達(dá)到20μmol/L時(shí),大部分細(xì)胞核裂解,已經(jīng)失去正常細(xì)胞核形態(tài)。
3. Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:隨著給藥濃度的增加,細(xì)胞早期凋亡率及總凋亡率增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說(shuō)明SSd可誘導(dǎo)LNCap細(xì)胞凋亡,并呈濃度依賴性。
4. Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá):隨著給藥濃度的增加,凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)逐漸減少,促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
5. 免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá):隨著給藥濃度的增加,共聚焦顯微鏡下觀察到LC3熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng),說(shuō)明LC3聚集增多,自噬增強(qiáng)。
6. Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、p62的表達(dá):隨著給藥濃度的增加,p62蛋白表達(dá)逐漸減少,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
7.Western Blot法檢測(cè)自噬抑制劑和自噬激活劑對(duì)SSd誘導(dǎo)的LNCap細(xì)胞自噬過(guò)程的影響:分別使用自噬抑制劑（3-MA）和自噬激活劑雷帕霉素（Rapamycin）,Western Blot結(jié)果顯示,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62的蛋白相對(duì)表達(dá)量均發(fā)生相應(yīng)變化。
參考文獻(xiàn)
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