背景[1-3]
細(xì)菌跨膜蛋白提取試劑盒是一種基于化學(xué)而非去污劑方法的高產(chǎn)膜蛋白提取試劑盒。細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒可以從各種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中提取膜蛋白，可用于純化膜蛋白的粗品制備及膜蛋白制備。提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便。
該試劑盒含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對(duì)蛋白的降解，為提取高質(zhì)量的蛋白提供了保證。提取的蛋白用于二維電泳。
如需要用于報(bào)告基因檢測(cè)、SDS-PAGE電泳檢測(cè)、Western blotting、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、酶活分析等下游實(shí)驗(yàn)的試劑盒。
細(xì)菌跨膜蛋白電泳圖
跨膜蛋白承擔(dān)各種生物功能，扮演重要角色。膜蛋白樣品的制備需要充分考慮到與下游的膠分析及質(zhì)譜分析等應(yīng)用配套，因此膜蛋白樣本制備成為一個(gè)難以逾越的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)制備膜蛋白樣品的方法是使用去污劑和表面活性劑增溶。去污劑處理會(huì)使膜蛋白喪失其天然結(jié)構(gòu)，因而妨礙了膜蛋白的功能研究。
使用方法：
1．每500μl細(xì)菌膜提取液A中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。
2．將菌液在低溫下10000×g離心5分鐘，收集菌體，用PBS洗菌體2次。
3．按每100mg濕重菌體樣本加入500μl抽提液A(大約菌體和提取液體積比1:2-1:3，完全淹沒(méi)菌體即可)，混勻，冰上放置2-3小時(shí)，中間每隔30分鐘振蕩混勻30秒。
4．將提取液在低溫下12000×g離心5分鐘，取上清。
5．在上清中加入10μl抽提液B，充分混勻。
6．在37℃水浴10分鐘。
7．在37℃1000×g離心3分鐘。
8．小心吸取管底部大約50μl液體。
9．用1-2倍膜蛋白溶解液C溶解該溶液，既得細(xì)菌膜蛋白樣品。
應(yīng)用[4][5]
用于辣椒素對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響及其降脂機(jī)制研究
辣椒素通過(guò)降低慢性、低程度炎癥反應(yīng)（CLGI）發(fā)揮降脂作用。以8周齡雌性KO小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物,分為3組,每組10只,在飼喂標(biāo)準(zhǔn)脂肪含量飼料、高脂肪含量飼料、高脂肪含量飼料+灌胃2 mg/kg辣椒素12周后,測(cè)定辣椒素作用后腸道中LPS受體Toll樣受體4（TLR4）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）炎性因子的表達(dá)、胞質(zhì)蛋白ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表達(dá)以及血液中LPS、TNF-α、和IL-6的濃度等CLGI相關(guān)指標(biāo)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn),辣椒素通過(guò)降低腸道中變形菌門的大腸桿菌屬、幽門螺桿菌屬、脫硫弧菌屬和薩特氏菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度,從而減少腸道中LPS的濃度,然后降低由TLR4的介導(dǎo)的TNF-α和IL-1β表達(dá)量,使腸道局部炎癥減弱;局部炎癥減弱導(dǎo)致緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)升高,腸道屏障功能得到恢復(fù),使腸道的通透性降低,減少了進(jìn)入血液循環(huán)中的LPS濃度;減輕的內(nèi)毒素血癥,導(dǎo)致血液中TNF-α和IL-6等炎性因子的濃度降低,減弱CLGI,從而最終達(dá)成辣椒素降脂減肥的作用,證實(shí)辣椒素通過(guò)降低CLGI發(fā)揮降脂作用的機(jī)制。
研究辣椒素對(duì)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和屏障功能的影響,體外試驗(yàn)驗(yàn)證辣椒素通過(guò)降低CLGI發(fā)揮降脂作用。運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)自行成功構(gòu)建了TRPV1基因敲除的腸上皮細(xì)胞株Caco-2(TRPV1-/-),并以其做為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?分為對(duì)照組、1μg/mL LPS組和1μg/mL LPS+75μM辣椒素3個(gè)試驗(yàn)組,測(cè)定細(xì)胞上TLR4、TNF-α、和IL-6的mRNA表達(dá)量、細(xì)胞上清液中TNF-α、和IL-6炎性因子的濃度、跨膜蛋白ZO-1和胞質(zhì)蛋白Occludin的mRNA和蛋白表達(dá)量以及細(xì)胞跨膜電阻值（TEER）。
參考文獻(xiàn)
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