背景^[1-3]

小鼠5羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠5羥色胺（5-HT）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠5羥色胺（5-HT）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

小鼠5羥色胺(5-HT)ELISA檢測(cè)圖

樣品收集、處理及保存方法

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

操作步驟

1. 從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3. 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

應(yīng)用^[4][5]

用于橋本甲狀腺炎對(duì)妊娠期小鼠海馬5-羥色胺的影響研究

通過(guò)建立甲狀腺功能正常的橋本甲狀腺炎妊娠小鼠模型,觀察橋本甲狀腺炎對(duì)妊娠小鼠曠場(chǎng)行為及海馬內(nèi)5-HT和受體表達(dá)水平的影響。

方法將70只5～6周齡NOD雌性小鼠,16只NOD雄性小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將雌性小鼠隨機(jī)分為正常懷孕組（CON組）、HT懷孕組（HT組）。通過(guò)豬甲狀腺球蛋白（pTg）聯(lián)合弗氏佐劑2次誘導(dǎo)免疫建立HT小鼠模型。

步驟:稱取25μg豬甲狀腺球蛋白（pTg）溶于100μl生理鹽水溶液中,注射器吸取完全弗氏佐劑（CFA）按1:1比例與pTg溶液混合于研缽中,冰浴條件下研磨至完全乳化。

在HT組小鼠尾根部1cm處皮下注射0.1 ml乳化劑。CON組注射含有等量生理鹽水的CFA乳化劑。14 d后將CFA替換成不完全弗氏佐劑（IFA）,與pTg混合制備成乳化液,同樣操作方法在HT組小鼠尾根部1 cm處皮下注射0.1 ml。CON組注射等量不含pTg的IFA乳化劑。

7周后將2組小鼠分別以2:1比例隨機(jī)與雄鼠合籠,交配10-12 h,雌鼠在陰道口形成陰道栓,視為交配成功,每組各隨機(jī)選取16只孕鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與情緒反應(yīng);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)電化學(xué)發(fā)光免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清甲狀腺激素及抗體水平;甲狀腺HE染色;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組小鼠海馬5-HT含量;Western blot及免疫組織化學(xué)法觀察各組小鼠海馬5-HT2CR含量及分布情況。

統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):與CON組相比,HT組小鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯算短,差異有統(tǒng)計(jì)性學(xué)意義（P<0.01）。

參考文獻(xiàn)

[1]Neuronal cell death.Fricker M,Tolkovsky AM,Borutaite V,Coleman M,Brown GC.Physiological Reviews.2018

[2]Monoamine modulation of the synaptic inhibition in the hippocampus.Bijak M.Acta neurobiologiae experimentalis.1996

[3]A case control study on psychiatric disorders in Hashimoto disease and euthyroid goitre:not only depressive but also anxiety disorders are associated with thyroid autoimmunity.Carta Mauro,Hardoy Maria,Carpiniello Bernardo,Murru Andrea,Marci Anna,Carbone Fiora,Deiana Luca,Cadeddu Mariangela,Mariotti Stefano.Clinical Practice and Epidemiology in Mental Health.2005

[4]Advances in Basic Research and Clinical Practice.J.P.Feighner,W.F.Boyer.John Wiley&Sons Ltd.1996

[5]夏琴.橋本甲狀腺炎對(duì)妊娠期小鼠海馬5-羥色胺的影響[D].安徽醫(yī)科大學(xué),2020.