背景[1-3]
ANTI-BAK抗體是用人工合成的人Bak蛋白Gly82附近一段多肽進(jìn)行適當(dāng)修飾后免疫rabbit，然后用protein A和抗原多肽親和柱經(jīng)過(guò)兩步純化得到的高純度抗體。Bak抗體識(shí)別的是總Bak(total Bak)，可以檢測(cè)內(nèi)源性的Bak蛋白水平，未發(fā)現(xiàn)和其它Bal-2家族蛋白有交叉反應(yīng)。BAK抗體產(chǎn)品為無(wú)色溶液形式，含有100 ug抗體.該產(chǎn)品濃度為0.5 mg/ml，溶解于包含有30%甘油，0.5%BSA，5 mM EDTA和0.01%硫柳汞的PBS（pH 7.2）緩沖液中。
Bak基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的bcl-2家族的同源類似物，具有211個(gè)氨基酸(約23.4 kDa)，能夠促進(jìn)細(xì)胞死亡，且對(duì)抗bcl-2對(duì)凋亡的保護(hù)作用。Bak與bcl_2及其家族成員有明顯結(jié)構(gòu)上的相似性，特別是BHI和B也結(jié)構(gòu)域。Bak與bcl-2、bcl-xL和Bax的同源性分別有25％、22％和19％。Bak在碳末端還含有疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明Bak蛋白以整合的膜蛋白的形式存在。
近兩年來(lái)，對(duì)Bak基因的研究逐漸深入。像Bax一樣，Bak基因產(chǎn)物能夠增加細(xì)胞對(duì)各種刺激的凋亡性反應(yīng)。Bak基因確實(shí)能夠顯著誘導(dǎo)HCC-9204細(xì)胞(p53基因已突變)發(fā)生凋亡。Bak基因可能作為p53基因突變的腫瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子，直接參與凋亡的發(fā)生。最近Manchester大學(xué)癌癥研究中心的一個(gè)小組針對(duì)Bak基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Bak能夠接受藥物引起的細(xì)胞凋亡信號(hào)并引起細(xì)胞損傷，Bak基因在正常情況下受到其它分子的控制。
為了達(dá)到活性狀態(tài)，Bak必須脫離目前的“記憶狀態(tài)”并發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。一旦構(gòu)象發(fā)生改變，Bak就會(huì)接受細(xì)胞損傷性刺激并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染Bak基因，增加細(xì)胞中Bak的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能作為腫瘤基因治療的一個(gè)新策略，特別是針對(duì)p53基因已發(fā)生突變的腫瘤。
應(yīng)用[4][5]
用于樺木醇誘導(dǎo)的人源癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bax、Bak以及Caspase-9重要調(diào)控作用的研究
活化的Caspases參與一系列蛋白質(zhì)的降解作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。通常有兩條主要途徑激活Caspases:一條是通過(guò)細(xì)胞表面死亡受體途徑,例如特異性配體結(jié)合的Fas等腫瘤壞死因子(TNF)家族,導(dǎo)致Caspase-8的激活,Caspase-8再依次激活下游的效應(yīng)Caspase,如Caspase-3,-6,和-7；
另一條是線粒體途徑,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡信號(hào)觸發(fā)線粒體釋放cytochrome c,隨后cytochrome c與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結(jié)合,后者募集Caspase-9并誘導(dǎo)其加工和激活。
線粒體外膜通透性的改變和cytochrome c的釋放受Bcl-2家族蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié),Bcl-2家族中促凋亡蛋白質(zhì)分子Bax和Bak可做特定的蛋白質(zhì)釋放通道。
細(xì)胞凋亡的失衡可引起腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖以及其對(duì)抗癌藥物的耐受,闡明細(xì)胞凋亡過(guò)程的分子機(jī)制,從而找到實(shí)施有效細(xì)胞凋亡方法,是治療人類癌癥的理想策略。
樺木醇(Betulin,BT),是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物,大量存在于灌木樹(shù)中,其含量高達(dá)樺樹(shù)皮干重的30%。因?yàn)闃迥敬季哂卸喾N藥理學(xué)性質(zhì),故可做化學(xué)藥物的前體化合物。目前,在結(jié)構(gòu)上與樺木醇的衍生物樺木酸,被證實(shí)具有細(xì)胞毒性作用,對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性。
選用人源宮頸癌細(xì)胞HeLa作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?對(duì)樺木醇抗癌細(xì)胞活性的分子機(jī)制進(jìn)行研究。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析觀察到：膜起泡、細(xì)胞核的凝縮和斷裂以及凋亡小體的形成等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),樺木醇作用HeLa細(xì)胞8小時(shí),細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白質(zhì),Caspase-3的底物PARP出現(xiàn)斷裂。
參考文獻(xiàn)
[1]Inhibition of SREBP by a Small Molecule,Betulin,Improves Hyperlipidemia and Insulin Resistance and Reduces Atherosclerotic Plaques[J].Jing-Jie Tang,Jia-Gui Li,Wei Qi,Wen-Wei Qiu,Pei-Shan Li,Bo-Liang Li,Bao-Liang Song.Cell Metabolism.2011(1)
[2]Hepatocellular Carcinoma:Current Management and Perspectives for the Future[J].Nuh N.Rahbari,Arianeb Mehrabi,Nathan M.Mollberg,Sascha A.Müller,Moritz Koch,Markus W.Büchler,Jürgen Weitz.Annals of Surgery.2011(3)
[3]Recognition of Smac‐mimetic compounds by the BIR domain of cIAP1[J].FedericaCossu,FrancescaMalvezzi,GiuliaCanevari,EloiseMastrangelo,DanieleLecis,DomenicoDelia,PierfaustoSeneci,CarloScolastico,MartinoBolognesi,MarioMilani.Protein Science.2010(12)
[4]Poly(ADP-ribosyl)ation polymerases:mechanism and new target of anticancer therapy[J].Heitz,Harter,Ewald-Riegler,Papsdorf,Kommoss,du Bois.Expert Review of Anticancer Therapy.2010(7)
[5]李楊.樺木醇誘導(dǎo)的人源癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bax、Bak以及Caspase-9重要調(diào)控作用的研究[D].吉林大學(xué),2011.