背景及概述^[1]

至今，硒(selenium)共價結(jié)合在蛋白質(zhì)中僅發(fā)現(xiàn)有硒半胱氨酸(selenocysteine，Sec)和硒甲硫氨酸(selenomethionine，Se-Met)兩種形式.Se-Met進(jìn)入蛋白質(zhì)可能是一隨機(jī)事件，即由Se-Met隨機(jī)替代甲硫氨酸而參入到蛋白質(zhì)分子中；相反，Sec則是由密碼子UGA介導(dǎo)的翻譯行為。一般把以Sec形式參入到多肽鏈的蛋白質(zhì)稱硒蛋白(selenoprotein)，而把其他結(jié)合硒的蛋白質(zhì)稱含硒蛋白。已發(fā)現(xiàn)的硒蛋白大多數(shù)是具有重要作用的酶，又稱之為硒酶(selenoenzyme)，在硒蛋白特別是硒酶的活性中心發(fā)現(xiàn)含有Sec，目前認(rèn)為硒蛋白是硒在機(jī)體內(nèi)存在的主要功能形式，Sec是生物合成和參入到蛋白質(zhì)分子中的第21種氨基酸。密碼子UGA介導(dǎo)Sec參入蛋白質(zhì)分子是對經(jīng)典生物化學(xué)的重要補充，但眾所周知，UGA同時是三個終止密碼子之一，在轉(zhuǎn)譯過程中，分子如何識別UGA為Sec密碼子而不當(dāng)作終止密碼子，是近年來硒蛋白分子生物學(xué)最具吸引力的研究熱點.這一過程在原核生物和真核生物之間存在許多差別，并在轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)上有其獨特之處.

種類

從病毒、細(xì)菌、真菌、無脊椎動物到脊椎動物都發(fā)現(xiàn)有硒蛋白或潛在的硒蛋白基因.如HIV、HBV、痘病毒等病毒的基因結(jié)構(gòu)中具有編碼硒蛋白的能力.傳染性軟疣病毒(MCV)含有與谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)同源的硒蛋白基因，編碼一種硒蛋白，對人角質(zhì)細(xì)胞抗UV輻射和超氧離子引起的細(xì)胞毒作用有保護(hù)作用，同時也為MCV提供保護(hù)；出血熱病毒也含有一種潛在的硒蛋白基因，經(jīng)PCR分析，它有17個UGA密碼子和數(shù)個SECIS(selenocysteineinsertionsequence，SECIS)元件，每分子蛋白質(zhì)可組裝16個Sec，研究者認(rèn)為該蛋白質(zhì)與病毒致病性有關(guān)。細(xì)菌的甲酸脫氫酶、甘氨酸還原酶等[2]為較早期發(fā)現(xiàn)的硒蛋白.還有人從真菌中分離出底物特異性硒蛋白B甘氨酸還原酶(PBglycinereductase)，放射性75Se標(biāo)記發(fā)現(xiàn)硒結(jié)合在47ku亞基上。小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)基因編碼有與哺乳動物同源的含硒酶硫氧還蛋白還原酶。在哺乳動物至少已發(fā)現(xiàn)并分離有35種硒蛋白，其中功能比較明確的硒蛋白是：谷胱甘肽過氧化物酶家族(glutathioneperoxidase，GPx1，GPx2，GPx3，GPx4)、脫碘酶家族(iodothyroninedeiodinases，ID1，ID2，ID3)、硫氧還蛋白還原酶家族(thioredoxinreductases，TR1，TR2，TR3)、硒磷酸化物合成酶(selenophosphatesynthetase，SPS2)、精子線粒體膜硒蛋白(MCS)、34ku精子DNA結(jié)合硒蛋白(34kuDNA-boundspermatidselenoprotein)、15ku前列腺上皮硒蛋白(15kuprostateepithelialselenoprotein)和人淋巴細(xì)胞硒蛋白(15kuhuman lymphocyticselenoprotein)、硒蛋白P(selenoproteinP)、硒蛋白W(selenoproteinW)和一種存在于多種組織中的18ku硒蛋白(18kuselenoprotein).它們具有防止膜結(jié)構(gòu)及生物大分子的氧化損傷；合成并調(diào)節(jié)活性甲狀腺素T3水平；參與DNA合成并調(diào)節(jié)DNA表達(dá)；促進(jìn)精子生成、發(fā)育、成熟及其活力的維持；保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和維護(hù)肌肉組織的正常功能等廣泛的生理作用.

制備^[1]

1.  原核生物硒蛋白合成

雖然Sec的合成及其引入到蛋白質(zhì)肽鏈中的過程極其復(fù)雜，且真核與原核生物間存在較大差異，但目前認(rèn)為，在原核生物，這一過程是在兩種順式作用元件(cis-actingelement)和四個翻譯因子協(xié)同作用下完成的。兩種順式作用元件：引導(dǎo)Sec特異性插入位點的Sec-UGA密碼子；位于UGA3′端臨近下游的介導(dǎo)Sec特異性插入的一種mRNA莖環(huán)(stemloop)樣二級結(jié)構(gòu)，即SECIS元件.四個翻譯因子：兩種有關(guān)Sec合成的酶，即硒磷酸化物合成酶和硒半胱氨酸合成酶；特異的載體tRNA[Sec]；特異的翻譯因子SELB.其對應(yīng)的基因和功能如表所示：

Sec的生成、運載及硒蛋白的合成過程如下：a.tRNA[Sec]在Ser-tRNA合成酶作用下，生成Ser-tRNA[Sec]；b.在硒磷酸化物合成酶作用下生成硒磷酸化物；c.Ser-tRNA[Sec]以絲氨酸為骨架，在硒半胱氨酸合成酶作用下，以硒磷酸化物為硒供體，形成硒半胱氨酰tRNA(SectRNA[Sec])；d.特異的翻譯因子結(jié)合并識別SECIS，介導(dǎo)Sec插入肽鏈.

2. 真核生物硒蛋白合成

在真核生物，關(guān)于Sec插入的確切機(jī)制至今不明.現(xiàn)有的資料表明，與原核生物相比，至少有以下不同.

1）哺乳動物硒蛋白的Sec-UGA密碼子

Sec-UGA體外翻譯實驗顯示，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中硒蛋白PGSH-PxmRNA不能翻譯相應(yīng)的Sec-UGA，但GSH-PxmRNA從啟始密碼子AUG到Sec-UGA相對應(yīng)的肽鏈可以在體外合成，這說明該密碼子仍起終止密碼子作用.硒蛋白三碘原腺甲氨酸脫碘酶(Ⅰ型脫碘酶)，在一過性轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)，其Sec-UGA仍可作為終止密碼子.因此，在哺乳動物mRNA相同位置的UGA可兼具截然不同的功能。

2）真核生物的SECIS元件

在真核生物，SECIS位于mRNA3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3′-untranslatedregions，3′-UTR)。 GPx和硒蛋白PmRNA有一段保守序列形成SECIS或STE，其序列、結(jié)構(gòu)和所在位置都與原核生物不同。事實上，存在于UGA密碼子下游至SECIS之間>1kb的序列為真核硒蛋白合成機(jī)制增添了諸多奧秘，此間可能有RNA-RNA或(和)RNA-蛋白質(zhì)因子的識別及相互作用.SBP(seleniumbindingprotein)的發(fā)現(xiàn)只是其中之一，它能特異地結(jié)合位于硒蛋白GPxmRNA3'UTR的SECIS元件，形成復(fù)合體.研究者認(rèn)為SBP可能就是真核生物的SELB。

3）哺乳動物Sec的轉(zhuǎn)運及其合成途徑

其載體為Sec-tRNA，又稱Sec-tRNA[Ser]Sec.其二、三級結(jié)構(gòu)與通常的tRNA和細(xì)菌tRNA有顯著不同，具有獨特的氨基酸長臂.在高等脊椎動物細(xì)胞中存在Sec的兩種同分異構(gòu)載體tRNA，它們的區(qū)別在于反密碼子的可擺動苷酸中2′-O核糖的甲基化態(tài)不同.該核苷酸的堿基都是5-甲氧基甲基尿嘧啶(mcmU)，而且這些tRNA還有三個不同的修飾堿基，它們的生物合成最近已在Xenopus卵母細(xì)胞中構(gòu)建.此外，tRNA[Ser]SecmcmU和tRNA[Ser]SecmcmUm(或其他2′-O甲基核糖的同源物)均能夠在蛋白質(zhì)合成時閱讀UGA密碼子，說明這些同分異構(gòu)受體能夠被延伸因子eEF-1識別.為進(jìn)一步證實tRNA[Ser]Sec的兩種?；问?即：Sec-tRNA [Ser]Sec和Ser-tRNA[Ser]Sec)在蛋白質(zhì)合成中的作用，有人用GPx和硒蛋白Pm RNA研究Sec-UGA的翻譯，同時以兔β-球蛋白mRNA終止密碼子UGA作為對照，并分析了延伸因子eEF-1對Sec-tRNA[Ser]Sec和Ser-tRNA[Ser]Sec的識別能力。

結(jié)果顯示，延伸因子eEF-1不識別SectRNA[Ser]Sec，卻易于識別Ser-tRNA[Ser]Sec.且在體外系統(tǒng)中，Ser-tRNA[Ser]Sec對GPxmRNA的Sec-UGA和終止密碼子UGA均有明顯的抑制作用，而Sec-tRNA[Ser]Sec卻無此作用。

硒蛋白與疾病的關(guān)系^[2-3]

在25種人硒蛋白中，目前生物功能研究較清楚的僅有GPx、Dio和TrxR；生物功能有一定了解、但尚有許多問題需深入研究的硒蛋白有SPS2、SelP、Sep15、SelW、SelM、SelR、SelS、SelT和SelH；生物功能完全未知的硒蛋白有SelI、SelK、SelO和SelV。盡管不同硒蛋白的生物功能各異，但其生化基礎(chǔ)主要是硒蛋白中Sec的氧化還原活性，如GPx參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原動態(tài)平衡，TrxR調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中二硫鍵與巰基的平衡、參與胞內(nèi)氧化還原信號傳導(dǎo)，Sep15參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上二硫鍵的形成，Dio通過氧化還原調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝，SelP通過抗氧化在腦神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮作用，SelR是蛋氨酸亞砜還原酶，SelW、SelM、SelH等通過氧化還原作用參與各種重要的生理環(huán)節(jié)。因此推測：硒蛋白通過氧化還原作用調(diào)節(jié)生理功能及其與疾病的關(guān)系。因篇幅所限，本文僅從硒與癌癥、神經(jīng)退行性病變和病毒三方面對硒與重大疾病的關(guān)系進(jìn)行概述。

1. 硒蛋白與癌癥預(yù)防

癌癥是致人類死亡的三大疾病之一。早年報道補硒200μg天能防止非惡性黑素瘤皮膚癌，降低患前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌發(fā)生的危險性，使前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌的發(fā)病率分別降低63%、58%和49%。為進(jìn)一步確定硒作為癌癥化學(xué)預(yù)防劑的有效性，又啟動了其它干預(yù)實驗。在干預(yù)實驗中最常用的硒劑量是200μg天，北美人使用的安全上限為400μg天，也有的干預(yù)實驗使用更高劑量，但整個療程需監(jiān)控硒的毒性。評估硒的營養(yǎng)狀況和預(yù)測硒毒性的生物記物有3種：血漿總硒、SelP和GPx。血漿SelP和GPx作為體內(nèi)硒蛋白的代表，用作硒營養(yǎng)標(biāo)記物，它們的濃度在缺硒條件下降低，但隨補硒而增加直至由遺傳因素和環(huán)境因素所確定的硒平臺。血總硒則包括了硒蛋白中以Sec形式存在的硒、所有蛋白中的蛋氨酸被硒取代而形成的Se-Met和小分子硒化合物(<總硒量的3%)。由于土壤中硒含量各不相同，世界各地硒攝入量也各不相同。中國某些地區(qū)硒攝入量≤10μg天，北美人的硒攝入量為80—140μg天，目前推薦給北美成年人的飲食硒量為55μg天。

人群干預(yù)實驗顯示補硒對癌癥的預(yù)防作用。在中國林縣癌癥高發(fā)區(qū)，補β-胡蘿卜素、維生素E和硒5.25年，癌癥總死亡率，尤其是胃癌死亡率，顯著性降低。給癌癥患者每天補充200μg硒，癌癥總死亡率顯著降低，肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的發(fā)病率也顯著降低。然而，補硒對預(yù)防非黑色素瘤皮膚癌無效。實驗結(jié)果還表明：在某些實驗系統(tǒng)中硒既可抑癌也可促癌。代營養(yǎng)干預(yù)預(yù)防癌癥的研究結(jié)果已有綜述。美國FDA對硒防癌作用的健康需求值也進(jìn)行了評估。高劑量硒的攝入具有防治前列腺癌發(fā)展的作用。在荷蘭進(jìn)行的6.3年人群實驗顯示：腳趾甲高硒濃度與低前列腺癌發(fā)生的危險性明顯相關(guān)。對日裔美國人超過20年的跟蹤實驗也證實血漿中高水平硒與前列腺癌發(fā)生的危險性降低呈相關(guān)性。另外一個13年跟蹤實驗表明：高硒水平能顯著降低前列腺危險性，尤其是對前列腺發(fā)生的特異抗原濃度等于或大于4ngml的人。有關(guān)硒預(yù)防前列腺癌的綜述均指出：補硒能降低前列腺癌發(fā)生的危險性]。然而英國和加拿大的大范圍病例-對照(case-controlstudy)卻認(rèn)為：盡管高劑量硒能預(yù)防前列腺癌，但腳趾甲硒與前列腺癌并不相關(guān)。近期也有報道歐洲人的血漿硒濃度與前列腺癌不相關(guān)。

血清低硒水平與結(jié)腸癌發(fā)生具有強相關(guān)性。低硒水平結(jié)腸癌病人的存活時間和存活率均顯著低于較高硒水平的病人。加拿大的病例-對照研究表明：腳趾甲硒水平與結(jié)腸癌危險性呈負(fù)相關(guān)。另外三項臨床實驗表明：在對年齡、性別、吸煙狀況、研究位點進(jìn)行調(diào)整后，測定1736位實驗參與者的血硒，發(fā)現(xiàn)硒水平高的結(jié)腸腺瘤患者，病狀復(fù)發(fā)的危險性低于低硒水平患者。然而，也有一些臨床實驗未能觀察到硒與結(jié)腸癌發(fā)生危險性的顯著相關(guān)在血漿硒水平、SelP濃度或GPx活性方面的差異。關(guān)于硒與肺癌的關(guān)系，許多報道指出：低硒人群，尤其是男性，患肺癌的危險性增高，硒對肺癌的保護(hù)作用十分明顯。芬蘭荷蘭兩國各自的研究結(jié)果均顯示硒預(yù)防肺癌具有劑量依賴性。血清硒水平與肺癌發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，血清硒水平低與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)缺失之間存在協(xié)同作用，使肺癌發(fā)生的危險性顯著增加。硒在某種程度上能預(yù)防肺癌，但只在低硒水平的人群中有效。然而，在一些非歐洲人群中，未觀察到血清、指甲中硒與肺癌發(fā)生危險性的相關(guān)性。當(dāng)硒被攝入體內(nèi)，90%以上摻入硒蛋白，僅5%存在于小分子代謝產(chǎn)物中。顯然，硒的抗癌活性來源于硒和硒蛋白的共同作用結(jié)果。硒蛋白在預(yù)防癌癥中作用與機(jī)理尚不十分清楚。癌癥相關(guān)硒蛋白報道較多的有GPx、TrxR和Sep15，另外，SelP和SelH與癌癥的關(guān)系也有少量報道

2. 硒蛋白與腦疾病

哺乳動物腦內(nèi)含有多種硒蛋白，如GPx1、GPx2、Trx1、Dio2、SelP、SelW、SelR(即MsrB)、Sep15、SelN、SelM等。缺硒動物肝、骨、血中硒水平僅為正常水平的1%，但在腦中硒出乎意料地達(dá)到對照組的60%。硒在成年人不同腦區(qū)的分布不同：灰質(zhì)比白質(zhì)含量高，硒在富含腺體的區(qū)域有聚集現(xiàn)象。SelP大量表達(dá)于小腦、嗅球、海馬區(qū)、額葉皮質(zhì)。除了腦細(xì)胞自身能合成硒蛋白外，有些硒蛋白能通過血腦屏障。向缺硒大鼠注射標(biāo)記75Se的GPx和SelP，75Se-SelP5min內(nèi)在血漿中消失、大部分被腦攝取。硒蛋白對補硒的響應(yīng)速度具有不同層次。缺硒時，在降低表達(dá)和酶活性方面，GPx4和Dio1比GPx1和GPx3響應(yīng)遲緩；而在重新補充硒時，這些響應(yīng)遲緩的硒蛋白卻響應(yīng)更快，從而在硒蛋白中處于較高層次。高層次蛋白比低層次蛋白清楚，但與缺硒相關(guān)的腦疾病已有許多報道，如阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD，又稱老年性癡呆癥)、癲癇、帕金森病、神經(jīng)分裂癥等。在中國農(nóng)村對2000位年齡≥65歲的老年人進(jìn)行了指甲低硒水平與認(rèn)知關(guān)系的調(diào)查，結(jié)果表明：終生處于低硒水平的人群與低認(rèn)知功能相關(guān)。下面僅對硒與AD病的關(guān)系和機(jī)制做一簡介。氧化應(yīng)激在多種神經(jīng)退行性疾病包括AD病中起作用，而硒化合物則作為抗氧化劑防止氧化損傷。有報道將原代大鼠海馬趾神經(jīng)細(xì)胞用硒代蛋氨酸(Se-Met)預(yù)處理16h后，再用Fe2+H2O2或淀粉樣β多肽(Aβ25—35)作用于細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Se-Met能顯著提高細(xì)胞存活率、降低ROS、提高GPx蛋白表達(dá)及活性。說明SeMet能通過對GPx的調(diào)控，降低Fe2+H2O2或Aβ誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基。因此有可能成為AD病的潛在治療劑。

硒可通過摻入硒蛋白來調(diào)節(jié)自由基的變化，使磷酸酯酶、激酶(MAPK，S6K，PI3K)、蛋白酶(caspase-3)和轉(zhuǎn)錄因子的活化處于平衡狀態(tài)[99]。Aβ肽在神經(jīng)炎斑的沉積與疾病密切相關(guān)。分泌酶介導(dǎo)Aβ肽的產(chǎn)生，γ-分泌酶對AD病的發(fā)展具有重要作用，嚴(yán)格控制γ-分泌酶活性是維持Aβ生成動態(tài)平衡所必需的。在AD病人腦中易感區(qū)域，3個主要的MAPK路徑JNK、ERK和p38激酶都被激活。與此一致，ERK通路的上游調(diào)節(jié)器，包括Ras、Raf和MEK12也在AD病人中被激活。亞硒酸鈉通過作用于ERKMAPK而抑制γ-分泌酶活性、減少Aβ產(chǎn)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，可以用ERK作為藥理學(xué)靶點篩選能夠降低Aβ的硒化合物?？刂粕攀澄粫苯右鹱园l(fā)式神經(jīng)功能缺失，但能敏化腦對神經(jīng)毒素引起的損傷，腦硒和胞內(nèi)GPx1活性僅略微降低。GPx1敲除小鼠中也未觀察到自發(fā)式神經(jīng)功能缺失，但這些小鼠更易受腦局部缺血和神經(jīng)毒素的攻擊，說明GPx1具有抵抗上述作用的能力。SelP缺乏的小鼠，腦硒和GPx、TrxR活性強烈降低，小鼠發(fā)展為癲癇和運動失調(diào)。在AD病患者腦中MsrA活性較低，β-淀粉體的Met35氧化介導(dǎo)產(chǎn)生自由基，可能危及腦中抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致AD病的發(fā)展。補充硒可提高硒蛋白MsrB活性，有可能通過還原被氧化的Met35而阻止或降低Aβ肽的聚集。盡管硒蛋白在預(yù)防神經(jīng)退行性疾病方面有誘人的前景，但目前尚處于初步研究階段，許多問題尚有待研究解決。

3. 硒與病毒

硒與柯薩奇病毒　宿主細(xì)胞內(nèi)硒的含量會影響許多入侵病毒的復(fù)制、突變及毒力。人群調(diào)查和病理學(xué)研究結(jié)果均指出：凡是缺硒的人，多種病毒感染后容易出現(xiàn)明顯的癥狀。我國是克山病(一種具有突發(fā)性的心肌疾病)高發(fā)地區(qū)，20世紀(jì)50年代后，首先發(fā)現(xiàn)該病與土壤及人群缺硒有關(guān)，采用長期對病區(qū)人群補硒的方法，目前已基本消滅了克山病。隨后發(fā)現(xiàn)克山病的病因主要與柯薩奇病毒有關(guān)，并用鼠的模型進(jìn)行了證實。1994年又發(fā)現(xiàn)該病毒的無毒株CVB30及有毒CVB320，在缺硒的細(xì)胞及大鼠中，無毒株能變?yōu)橹虏〉挠卸局?。缺硒及不缺硒鼠感染了無毒株及有毒株的心肌損傷情況示于圖3。缺硒細(xì)胞中無毒株發(fā)生的突變主要為5′-端非編碼區(qū)nt234位點的C變?yōu)閁。另外，在免疫系統(tǒng)受嚴(yán)重?fù)p傷的大鼠中，無毒株亦容易變?yōu)橹虏⌒圆《?。用敲除GPx1基因的大鼠做實驗，在接種無毒株CVB30后，敲除GPx1基因的大鼠50%出現(xiàn)心肌疾病，而野生型大鼠基本沒有出現(xiàn)病變，說明病毒的毒力與細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)有關(guān)。

主要參考資料

[1] 硒蛋白的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

[2] 硒蛋白的分子生物學(xué)及與疾病的關(guān)系

[3] 硒蛋白、硒與內(nèi)分泌激素的關(guān)系研究進(jìn)展