胺基活化的瓊脂糖可以用于含羧基或含醛的分子。耦合化學是基于碳二亞胺的,是一項成功且有據可查的技術。
胺基活化瓊脂糖層析填料(Amine-activated SepFast)與含有羧基的配體形成化學穩(wěn)定的酰胺鍵,它有一個長間隔區(qū)(9個原子)。預活化的瓊脂糖基質可以用于制造各種定制的親和層析吸附劑,適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應用。
- 屬性
胺基活化瓊脂糖層析填料(Amine-activated SepFast 4 High Flow)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機械剛度,可在降低背壓的情況下實現(xiàn)高流量。
由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結合特性,長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結構,對大蛋白質分子具有出色的傳質性能。
通過在末端連接帶有胺基的長親水鏈來激活基礎基質。在碳二亞胺試劑存在下與含羧基配體反應,或在還原劑存在下與含醛配體反應。胺基活化瓊脂糖層析填料(Amine-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。
表1 胺基活化瓊脂糖層析填料(Amine-activated SepFast)的特性
- 配體固定化
以下是含羧基配體一般的偶聯(lián)流程。
2.1 將目標配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中,將pH值調整為4.5。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。
2.2 在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗胺活化凝膠。
2.3 將洗凈并吸干的凝膠(來自步驟 2.2)轉移到步驟2.1 制備的溶液中。
2.4 將碳二亞胺作為干粉或預先溶解的溶液添加到漿液中,最終濃度為0.1 M。如果碳二亞胺預先溶解在水中,則將pH值調整為4.5。
2.5 在室溫或4-8℃下混合漿料。
2.6 在第1個小時內通過添加 0.1 M NaOH調節(jié)反應pH值至4.5。
2.7 將偶聯(lián)反應放置2-24小時。
2.8 用5倍體積的0.1 M 醋酸鹽緩沖液 + 0.5 M NaCl,pH 4.0洗滌凝膠,然后用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl,pH 8.0洗滌凝膠。重復上述洗滌2次以上。
2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。
- 固定化效率的一般考慮
3.1 pH
偶聯(lián)反應在pH 4.5 - 7.5之間非常有效地進行。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)pH以獲得結果(例如,高偶聯(lián)產率和高配體活性)。
在偶聯(lián)反應的第1個小時內,pH值會降低。要記得通過添加0.1 M NaOH來調節(jié)偶聯(lián)pH值。之后pH值會趨于穩(wěn)定。
3.2 偶聯(lián)方案
去離子水可直接用作偶聯(lián)溶液。應避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液,因為它們會與配體偶聯(lián)發(fā)生競爭。
可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度。應事先測試此類溶劑的適用性。
3.3 碳二亞胺的選擇
應使用水溶性碳二亞胺,例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺 (EDC) 或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基) 碳二亞胺 (CMC)(通常合成為 metho?p?甲苯磺酸鹽)。EDC是最常用的碳二亞胺試劑。
3.4 碳二亞胺的濃度
添加的碳二亞胺的量應以化學計量的方式超過活化的胺基。建議以最終反應漿料中的0.1 M作為起點。
3.5 反應時間和溫度
可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化填料之間的接觸時間以保持配體的生物活性。
典型的反應時間是在室溫或冷藏室中過夜。
3.6 屏蔽剩余的活化配體
如果加入過量的配體,則可能不需要封閉殘留的活化基團。
未與配體反應的活化基團應在碳二亞胺存在下通過添加含有pH 8 - 9伯胺的額外小分子(例如1 M乙醇胺)來封端。
3.7 最終填料的洗滌
偶聯(lián)反應后需要將未連接或弱連接的配體完全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質。
- 固定化親和填料的使用
配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質相同的原則。
- 儲存
胺基活化瓊脂糖層析填料(Amine-activated SepFast)應在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕填料應在防菌劑(例如20%乙醇)存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合填料。
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