CNBr-activated SepFast MAG是一種磁性瓊脂糖樹脂，可以用于制造各種磁性親和色譜介質(zhì)，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。
CNBr-activated SepFast MAG在制備和使用定制親和層析介質(zhì)方面具有良好的記錄。將生物特異性配體與CNBr 活化的瓊脂糖偶聯(lián)是一種廣泛使用、成功且有據(jù)可查的技術(shù)。偶聯(lián)反應(yīng)是自發(fā)的、快速的并且易于進(jìn)行。不需要有毒化學(xué)品或特殊設(shè)備。
應(yīng)用領(lǐng)域包括蛋白質(zhì)、多肽和核酸的固定化。
- 屬性
CNBr-activated SepFast MAG 4 HF由高度交聯(lián)的4%磁性瓊脂糖制成。它可以在更嚴(yán)苛的條件下操作使用，因此可以應(yīng)用低pH值和某些高濃度有機(jī)溶劑。
由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。
基礎(chǔ)基質(zhì)與溴化氫（CNBr）反應(yīng)生成活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)與待固定分子中的伯胺基團(tuán)反應(yīng)。CNBr-activated SepFast MAG以含有添加劑的凍干粉形式提供。
表1 CNBr-activated SepFast MAG 4HF的特性
- 配體固定化
2.1 培養(yǎng)基的預(yù)處理
CNBr-activated SepFast MAG以含有添加劑的凍干粉末形式提供。這些添加劑必須在偶聯(lián)反應(yīng)前洗掉。使用足夠量的低 pH 洗滌液以保持反應(yīng)基團(tuán)的活性。
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- 稱取所需的粉末（1 g干粉提供約3 ? 5 ml固定體積的介質(zhì)）并將其懸浮在預(yù)冷的 1 mM HCl中（1 g 干粉使用10 mL 1 mM HCl）。讓介質(zhì)在低溫下膨脹30分鐘。
- 在重力流或受控慢流下，在過濾裝置中用冷的1 mM HCl 清洗凝膠。所需酸的總體積為15到 20 個凝膠體積。洗滌后的介質(zhì)應(yīng)立即用于以下偶聯(lián)步驟。
2.2配體偶合
以下是一般的配體偶聯(lián)程序。
2.2.1 將目標(biāo)配體溶解在含有0.5 M NaCl的0.1 M NaHCO3，pH 8.3的偶聯(lián)緩沖液中。對于蛋白質(zhì)配體，凝膠濃度為5-20 mg/ml。對于小配體，凝膠濃度為1-10 µmol/ml 。偶聯(lián)緩沖液的體積應(yīng)與固定凝膠的體積相同。
2.2.2 將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟 2.1.2）轉(zhuǎn)移到上述溶液中。
2.2.3 漿液在4℃下混合過夜或在室溫下混合3-4小時。
2.2.4 用至少5 倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠。
2.2.5 將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液中，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0 或1 M乙醇胺 pH 8.0，持續(xù)2 - 3小時。
2.8 用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。
2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。
- 固定化效率的一般考慮
3.1 pH
pH 8.3的緩沖液最常用于蛋白質(zhì)固定。然而偶聯(lián)pH值可在6-10之間進(jìn)行優(yōu)化以獲得結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。
注意：配體溶解后要調(diào)節(jié)偶聯(lián)pH值。
3.2 偶聯(lián)方案
應(yīng)避免使用含有氨基的溶液。
可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性。
3.3 鹽
偶聯(lián)緩沖液加入鹽可以提高固定效率。
3.4 基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化基團(tuán)
對于某些配體或應(yīng)用，基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化水平可能過高，偶聯(lián)配體的活性可能會降低。
在降低的pH值下偶聯(lián)可能會減少配體分子的連接點。它可以提高偶聯(lián)配體的活性。活化基團(tuán)的受控水解，例如在添加配體前幾個小時用偶聯(lián)緩沖液孵育凝膠，也可以減少過度偶聯(lián)問題。
3.5 屏蔽剩余的活化配體
未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)通過添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如Tris或乙醇胺）來封端。
3.6 最終介質(zhì)的洗滌
偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體完全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。
- 固定化親和介質(zhì)的使用
配體偶聯(lián)介質(zhì)可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。
- 儲存
凍干的CNBr-activated SepFast MAG應(yīng)在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕介質(zhì)應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合介質(zhì)。
- 更多信息
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