膜片鉗技術(shù)的發(fā)展歷史

1976 年，在德國(guó)馬普生物物理化學(xué)研究所，Neher 和 Sakmann 在青蛙肌細(xì)胞上進(jìn)行了一項(xiàng)具有開(kāi)創(chuàng)性的實(shí)驗(yàn)。他們使用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)，成功記錄到了 ACh 激活的單通道離子電流，由此，膜片鉗技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。這一創(chuàng)舉如同在細(xì)胞電生理領(lǐng)域點(diǎn)亮了一盞明燈，為后續(xù)研究開(kāi)辟了全新的道路。

時(shí)間來(lái)到 1980 年，Sigworth 等人在該技術(shù)上取得了重大突破。他們?cè)谟涗涬姌O內(nèi)施加 5 - 50 cmH?O 的負(fù)壓吸引，實(shí)現(xiàn)了 10 - 100GΩ 的高阻封接（Giga - seal）。這一成果意義非凡，它極大地降低了記錄時(shí)的噪聲，使得單根電極既能鉗制膜片電位，又能記錄單通道電流，打破了以往的技術(shù)局限。

1981 年，Hamill 和 Neher 等對(duì)膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)。他們引入了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)，讓這一技術(shù)更加完善。改進(jìn)后的技術(shù)具備了令人驚嘆的分辨率，包括 1pA 的電流靈敏度、1μm 的空間分辨率和 10μs 的時(shí)間分辨率，為深入研究細(xì)胞電生理特性提供了強(qiáng)有力的工具。

1983 年 10 月，《Single - Channel Recording》一書(shū)的問(wèn)世，成為了膜片鉗技術(shù)發(fā)展歷程中的一座里程碑。Sakmann 和 Neher 也因其卓越的工作和突出貢獻(xiàn)，在 1991 年榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)，這一榮譽(yù)實(shí)至名歸，是對(duì)他們?cè)谀てQ技術(shù)領(lǐng)域開(kāi)創(chuàng)性工作的高度認(rèn)可。

膜片鉗技術(shù)的基本原理與特點(diǎn)

膜片鉗技術(shù)在本質(zhì)上屬于電壓鉗范疇，但它與傳統(tǒng)電壓鉗有著顯著區(qū)別。一方面，二者固定膜電位的方法不同；另一方面，它們固定電位的細(xì)胞膜面積不同，這也導(dǎo)致所研究的離子通道數(shù)目存在差異。

電壓鉗技術(shù)主要是通過(guò)維持細(xì)胞跨膜電位不變，并迅速控制其數(shù)值，以此來(lái)觀(guān)察在不同膜電位條件下的膜電流情況。這種技術(shù)適用于研究整個(gè)細(xì)胞膜或大塊細(xì)胞膜上所有離子通道的活動(dòng)，在巨大細(xì)胞的全性能電流研究中有著重要應(yīng)用，尤其是在分子克隆的卵母細(xì)胞表達(dá)電流的鑒定方面，發(fā)揮著不可替代的作用。然而，電壓鉗技術(shù)也存在明顯缺陷，它需要在細(xì)胞內(nèi)插入兩個(gè)電極，這對(duì)細(xì)胞損傷較大，對(duì)于小細(xì)胞（如中樞神經(jīng)元）而言，這種方法很難實(shí)現(xiàn)。而且由于細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜，很難保證細(xì)胞膜各處生物特性的一致。

膜片鉗技術(shù)則巧妙地利用了負(fù)反饋電子線(xiàn)路，將微電極尖端吸附的僅幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜電位固定在特定水平，從而能夠?qū)νㄟ^(guò)通道的微小離子電流進(jìn)行動(dòng)態(tài)或靜態(tài)觀(guān)察，進(jìn)而研究其功能。在膜片鉗技術(shù)中，形成高阻密封是實(shí)現(xiàn)膜電流固定的關(guān)鍵步驟，這個(gè)密封在玻璃微電極尖端邊緣與細(xì)胞膜之間產(chǎn)生，其阻抗數(shù)值可達(dá) 10 - 100GΩ（此密封電阻是指微電極內(nèi)與細(xì)胞外液之間的電阻）。由于這個(gè)阻值極高，近乎絕緣，其上的電流可視為零。形成高阻密封的力包括氫鍵、范德華力、鹽鍵等。這種密封不僅在電學(xué)上接近絕緣，在機(jī)械上也相當(dāng)牢固。同時(shí)，由于玻璃微電極尖端管徑很小，其下方的膜面積僅約 1μm²，在這么小的面積上離子通道數(shù)量很少，一般只有一個(gè)或幾個(gè)通道，從這一個(gè)或幾個(gè)通道流出的離子數(shù)量相對(duì)于整個(gè)細(xì)胞來(lái)說(shuō)極少，可以忽略不計(jì)。也就是說(shuō)，電極下的離子電流對(duì)整個(gè)細(xì)胞的靜息電位影響微小，只要保持電極內(nèi)電位不變，電極下那一小片細(xì)胞膜兩側(cè)的電位差就保持不變，從而實(shí)現(xiàn)電位固定。

此外，高阻封接技術(shù)還顯著降低了電流記錄的背景噪聲，極大地提高了時(shí)間、空間及電流分辨率，時(shí)間分辨率可達(dá) 10μs、空間分辨率可達(dá) 1 平方微米、電流分辨率可達(dá) 10?¹²A。影響電流記錄分辨率的背景噪聲除了來(lái)自膜片鉗放大器本身外，最主要的還是信號(hào)源的熱噪聲。根據(jù)公式 σn = 4Kt△f/R（其中 σn 為電流的均方差根，K 為波爾茲曼常數(shù)，t 為絕對(duì)溫度，△f 為測(cè)量帶寬，R 為電阻值）可知，要獲得低噪聲的電流記錄，信號(hào)源的內(nèi)阻必須非常高。例如，在 1kHz 帶寬、10% 精度的條件下，記錄 1pA 的電流，信號(hào)源內(nèi)阻應(yīng)為 2GΩ 以上。電壓鉗技術(shù)由于只能測(cè)量?jī)?nèi)阻通常在 100kΩ - 50MΩ 的大細(xì)胞的電流，無(wú)法通過(guò)常規(guī)技術(shù)和制備達(dá)到如此高的分辨率。

膜片鉗記錄的幾種形式

高阻封接問(wèn)題的成功解決，不僅改善了電流記錄性能，還催生出了多種用于研究通道電流的膜片鉗方式。根據(jù)不同的研究目的，可以制成不同的膜片構(gòu)型。

1.細(xì)胞吸附膜片（cell - attached patch）：將經(jīng)過(guò)兩次拉制和加熱拋光處理的微管電極放置在清潔的細(xì)胞膜表面上，形成高阻封接，這樣就在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜。隨后通過(guò)微管電極對(duì)膜片進(jìn)行電壓鉗制，能夠高分辨率地測(cè)量膜電流，這就是細(xì)胞貼附膜片，也稱(chēng)為細(xì)胞膜上的膜片記錄。由于這種方式不破壞細(xì)胞的完整性，此時(shí)跨膜電位由玻管固定電位和細(xì)胞電位共同決定。因此，為了測(cè)定膜片兩側(cè)的電位，需要先測(cè)定細(xì)胞膜電位，然后從該電位中減去玻管電位。從膜片的通道活動(dòng)角度來(lái)看，這種形式的膜片非常穩(wěn)定，因?yàn)榧?xì)胞骨架及相關(guān)代謝過(guò)程保持完整，受到的干擾較小。

2.內(nèi)面向外膜片（inside - out patch）：在高阻封接形成后，輕輕提起微管電極，使其與細(xì)胞分離，此時(shí)電極端會(huì)形成一個(gè)密封小泡。將這個(gè)小泡在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再放回溶液中，就得到了 “內(nèi)面向外” 膜片。在這種情況下，膜片兩側(cè)的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制，浴槽電位為地電位，膜電位等于玻管電位的負(fù)值。如果放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的，那么輸出將與膜電流（Im）的負(fù)值相等。

3.外面向外膜片（out - side patch）：高阻封接形成后，繼續(xù)用負(fù)壓抽吸，使膜片破裂，然后將玻管慢慢地從細(xì)胞表面垂直提起，斷端游離部分會(huì)自行融合成脂質(zhì)雙層，此時(shí)高阻封接仍然存在，而膜的外側(cè)面接觸浴槽液。對(duì)于這種膜片形式，需要測(cè)量膜片電阻，并消除漏電流和電容電流，整個(gè)過(guò)程要注意是否形成囊泡。如果浴槽保持地電位水平，膜電位就與玻管電位相等。若放大器是非反向的，放大器的輸出將與 Im 值相等。

4.全細(xì)胞記錄構(gòu)型（whole - cell recording）：高阻封接形成后，繼續(xù)以負(fù)壓抽吸使電極管內(nèi)細(xì)胞膜破裂，電極胞內(nèi)液直接相通，且與浴槽液絕緣，這種形式就是 “全細(xì)胞” 記錄。它既可以記錄膜電位，也可以記錄膜電流。其中膜電位可以在電流鉗情況下記錄，或者將玻管連接到標(biāo)準(zhǔn)高阻微電極放大器上進(jìn)行記錄。在電壓鉗條件下，記錄到的大細(xì)胞全細(xì)胞電流可達(dá) nA 級(jí)。在全細(xì)胞鉗時(shí)，需要對(duì)串聯(lián)電阻（玻管和細(xì)胞內(nèi)部之間的電阻）進(jìn)行補(bǔ)償，因?yàn)槿魏瘟鹘?jīng)膜的電流都會(huì)流經(jīng)這個(gè)電阻，所引起的電壓降會(huì)使玻管電壓不同于細(xì)胞內(nèi)的真正電位，而且電流越大，越需要對(duì)串聯(lián)電阻進(jìn)行補(bǔ)償。全細(xì)胞鉗還需要注意細(xì)胞大小要合理，保證其電流能被放大器檢測(cè)到（25 - 50nA），減少串聯(lián)電阻的方法是使玻管尖比單通道記錄時(shí)大。

膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用

膜片鉗技術(shù)自誕生以來(lái)，不斷發(fā)展，如今已成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理研究的常規(guī)方法，在基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)研究中都有著不可或缺的地位。

目前，膜片鉗技術(shù)在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，包括神經(jīng)（腦）科學(xué)、心血管科學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理生理學(xué)、中醫(yī)藥學(xué)、植物細(xì)胞生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)生理等。隨著全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)（Automatic patchclamp technology）的出現(xiàn)，膜片鉗技術(shù)憑借其自動(dòng)化、高通量的特性，在藥物研發(fā)和藥物篩選領(lǐng)域展現(xiàn)出了強(qiáng)大的生命力。

1.膜片鉗在通道研究中的關(guān)鍵作用：膜片鉗技術(shù)為離子通道研究提供了獨(dú)特的視角。它能夠直接觀(guān)察和分辨單離子通道電流及其開(kāi)閉時(shí)程，清晰地區(qū)分離子通道的離子選擇性，還能幫助發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型。在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計(jì)算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開(kāi)放概率，并且可以研究胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對(duì)離子通道開(kāi)閉及通道電流的影響等。同時(shí)，該技術(shù)在研究細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分泌機(jī)制方面也發(fā)揮著重要作用。結(jié)合分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)，膜片鉗技術(shù)還可用于探究離子通道分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能之間的關(guān)系。

此外，膜片鉗技術(shù)在藥物在其靶受體上作用位點(diǎn)的分析方面也有出色表現(xiàn)。以神經(jīng)元煙堿受體為例，它是一種配體門(mén)控性離子通道，通過(guò)膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)記錄煙堿誘發(fā)電流，能夠直觀(guān)地呈現(xiàn)神經(jīng)元煙堿受體活動(dòng)的全過(guò)程，包括受體與其激動(dòng)劑和拮抗劑的親和力、離子通道開(kāi)放和關(guān)閉的動(dòng)力學(xué)特征以及受體的失敏等活動(dòng)。利用該技術(shù)觀(guān)察拮抗劑對(duì)煙堿受體激動(dòng)劑量效曲線(xiàn)的影響，可以確定其作用的動(dòng)力學(xué)特征。再根據(jù)分析拮抗劑對(duì)受體失敏的影響、拮抗劑的作用是否有電壓依賴(lài)性、使用依賴(lài)性等特點(diǎn)，就能從功能上區(qū)分拮抗劑在煙堿受體上的不同作用位點(diǎn)，判斷拮抗劑是作用在受體的激動(dòng)劑識(shí)別位點(diǎn)、離子通道還是其他變構(gòu)位點(diǎn)上。

2.與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道：心肌細(xì)胞正常功能的維持依賴(lài)于各種離子通道對(duì)膜電位和動(dòng)作電位穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者在人類(lèi)心肌細(xì)胞離子通道特性研究方面取得了諸多進(jìn)展，這使得心肌藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物細(xì)胞模型向人心肌細(xì)胞模型轉(zhuǎn)變成為可能，為深入研究心肌相關(guān)疾病和藥物作用機(jī)制提供了更精準(zhǔn)的方向。

3.對(duì)離子通道生理與病理情況下作用機(jī)制的研究：通過(guò)對(duì)不同生理或病理狀態(tài)下細(xì)胞膜上某種離子通道特性的研究，可以深入了解該離子的生理意義以及在疾病過(guò)程中的作用機(jī)制。例如，在對(duì)鈣離子在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損害中作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損害過(guò)程中，Ca²?介導(dǎo)現(xiàn)象起著至關(guān)重要的作用。缺血缺氧會(huì)使 Ca²?通道開(kāi)放，過(guò)多的 Ca²?進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致 Ca²?超載，進(jìn)而引起神經(jīng)元及細(xì)胞膜損害、膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，嚴(yán)重情況下可使神經(jīng)元壞死。

4.對(duì)單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究：將膜片鉗技術(shù)與單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)相結(jié)合，在全細(xì)胞膜片鉗記錄的同時(shí)，將單細(xì)胞內(nèi)容物或整個(gè)細(xì)胞（包括細(xì)胞膜）吸入電極中，把細(xì)胞內(nèi)存在的各種 mRNA 全部快速逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再通過(guò)常規(guī) PCR 擴(kuò)增及待檢的特異 mRNA 的檢測(cè)，這樣可以對(duì)形態(tài)相似但電活動(dòng)不同的結(jié)果從分子水平進(jìn)行解釋?zhuān)蛘邽閱渭?xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供標(biāo)本，為同一結(jié)構(gòu)中形態(tài)相似但功能不同的現(xiàn)象提供分子層面的依據(jù)。目前，國(guó)際上掌握這種技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室較少，我國(guó)北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所于 1994 年在國(guó)內(nèi)率先開(kāi)展了相關(guān)研究。

5.對(duì)藥物作用機(jī)制的研究：在通道電流記錄過(guò)程中，可以在不同時(shí)間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，以此研究藥物對(duì)通道功能的影響，從而了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動(dòng)物生理功能的分子機(jī)理。這是膜片鉗技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，無(wú)論是西藥藥物機(jī)制的探討，還是中藥藥理的研究，都有廣泛應(yīng)用。例如，有研究報(bào)道采用細(xì)胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀(guān)測(cè)到人參二醇組皂苷可抑制正常和 “缺血” 誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元 L - 型鈣通道的開(kāi)放，從而減少鈣內(nèi)流，對(duì)缺血細(xì)胞可能有保護(hù)作用。還有研究采用細(xì)胞貼附式單通道記錄法發(fā)現(xiàn)烏頭堿對(duì)培養(yǎng)的 Wistar 大鼠心室肌細(xì)胞 L - 型鈣通道有阻滯作用。

6.在心血管藥理研究中的應(yīng)用：膜片鉗技術(shù)在心血管領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使人們對(duì)血管疾病和藥物作用的認(rèn)識(shí)不斷更新，在病因?qū)W和藥理學(xué)方面形成了許多新的觀(guān)點(diǎn)。正如諾貝爾基金會(huì)在頒獎(jiǎng)時(shí)所說(shuō)：“Neher 和 Sadmann 的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理，為研制新的更為特效的藥物開(kāi)辟了道路”，膜片鉗技術(shù)在心血管藥理研究中的重要性不言而喻。

7.創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選：目前，在離子通道高通量篩選中，主要進(jìn)行的是樣品量大、篩選速度占優(yōu)勢(shì)、信息量要求不太高的初級(jí)篩選。近年來(lái)，分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎(chǔ)的兩大主流技術(shù)市場(chǎng)。將電生理研究信息量大、靈敏度高的特點(diǎn)與自動(dòng)化、微量化技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了自動(dòng)化膜片鉗等新技術(shù)。

總的來(lái)說(shuō)，膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)取代了電壓鉗技術(shù)，是細(xì)胞電生理研究領(lǐng)域的一次重大飛躍。它讓離子通道的研究從宏觀(guān)層面深入到微觀(guān)層面，將昔日的 “肉湯生理學(xué)（broth physiology）” 與 “閃電生理學(xué)（lightning physiology）” 在分子水平上有機(jī)結(jié)合起來(lái)，使人們對(duì)膜通道的認(rèn)識(shí)煥然一新。當(dāng)前，生理學(xué)、生物物理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等多學(xué)科正將膜片鉗技術(shù)與膜通道蛋白重組技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)、光譜技術(shù)等非電生理技術(shù)相互結(jié)合，共同對(duì)離子通道展開(kāi)全面深入的研究。不少實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將基因工程與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合，把通道蛋白有目的地重組于人工膜中進(jìn)行研究，甚至設(shè)想將合成的通道蛋白分子植入機(jī)體，替換有缺陷和異常的通道功能，從而達(dá)到治療的目的。

上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司

試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實(shí)驗(yàn)服務(wù) | 供應(yīng)鏈

免費(fèi)熱線(xiàn)：4008-168-068

咨詢(xún)郵箱：info@univ-bio.com

訂購(gòu)商城：www.univ-bio.com

微信公眾平臺(tái)：優(yōu)寧維抗體專(zhuān)家，歡迎關(guān)注！

小優(yōu)博士（小程序）：5大課堂, 讓你的科研不再難！