細(xì)胞因子是一類分泌型的小分子蛋白（肽），其分子量在6-70 kDa之間¹，包括白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子²，它們在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞間通訊及多種細(xì)胞和免疫功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，細(xì)胞生長與分化、趨化及促血管生成³。

細(xì)胞因子的產(chǎn)生受到嚴(yán)格調(diào)控。由于大多數(shù)細(xì)胞因子具有較高生物活性，它們在體液中的穩(wěn)態(tài)濃度較低。在健康個體中，細(xì)胞因子在體液或組織中可能檢測不到，或者以pg/mL 濃度存在¹。細(xì)胞因子濃度升高可能表明與炎癥或疾病進(jìn)展相關(guān)的通路被激活⁴，因此常被用作生物標(biāo)志物，用于了解和預(yù)測疾病進(jìn)展及監(jiān)測治療效果。細(xì)胞因子的檢測對于疾病研究和臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

本文旨在介紹目前常用的細(xì)胞因子檢測技術(shù)，包括：
1、單指標(biāo)檢測技術(shù)：ELISA，WB，TR-FRET
2、多指標(biāo)檢測技術(shù)：Luminex、CBA、抗體芯片
3、超靈敏多指標(biāo)檢測技術(shù)：MSD、PEA、Simoa®
4、單細(xì)胞水平的細(xì)胞因子檢測：ELISpot、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜流式
5、質(zhì)譜檢測技術(shù)
6、常用細(xì)胞因子檢測方法比較

常見免疫檢測原理
細(xì)胞因子檢測/定量常依賴于免疫檢測。免疫檢測利用抗體的高特異性識別來檢測目的蛋白。常見免疫檢測的靈敏度通常在1-100 pg/mL之間，檢測原理為雙抗體夾心法或直接法。

（A）雙抗體夾心法：使用一對配對的捕獲抗體和檢測抗體。捕獲抗體固定在如96孔板、微珠、玻璃或膜等固相載體上。檢測抗體與酶、熒光標(biāo)簽或DNA標(biāo)簽偶聯(lián)，通過機(jī)器檢測其信號，實現(xiàn)對細(xì)胞因子的定量；
（B）直接法：將捕獲抗體固定在載體上，對分析樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，與抗體孵育。

圖：常見免疫檢測的原理³
 

免疫檢測對細(xì)胞因子的定量通常由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出，標(biāo)準(zhǔn)曲線由數(shù)個已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品測得的信號值繪制，以此推算未知樣本的濃度。

在免疫檢測中，樣品成分（如其他蛋白質(zhì)、離子、鹽、pH 值或樣品粘度）會對抗體表位的可及性、抗體與抗原的特異性/非特異性結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)烈影響，被稱為基質(zhì)效應(yīng)。盡可能地減少基質(zhì)效應(yīng)是降低背景和準(zhǔn)確定量的前提，可采用的方法是使標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)組成與樣本背景相似，或?qū)悠愤M(jìn)行稀釋等。此外，檢測應(yīng)設(shè)置合適的對照，例如陰性對照、陽性對照、質(zhì)控品（已測量的樣品）等，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性³。

點此查看細(xì)胞因子 Bio-marker 檢測樣本制備指南 

備注：
1. 下文列出的種屬、樣本類型、靈敏度、線性范圍及實驗步驟等信息僅供參考，具體信息請查看試劑盒說明書
2. 標(biāo)注樂備實可提供檢測服務(wù)的技術(shù)，樂備實均可提供全套實驗服務(wù)，包含樣本處理、實驗操作、上機(jī)檢測、數(shù)據(jù)分析等。上海樂備實生物技術(shù)有限公司，簡稱樂備實(LabEx)，是主要專注于提供多組學(xué)/多因子相關(guān)檢測分析的實驗服務(wù)專家，具備全面的一站式生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)平臺。已經(jīng)為超過3500個客戶提供服務(wù)，目前年檢測樣本超過30萬，受到廣大客戶的贊賞。

單指標(biāo)檢測技術(shù)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)
樂備實可提供檢測服務(wù)

ELISA是基礎(chǔ)和臨床研究中對單一分析物進(jìn)行定量分析的重要技術(shù)，可廣泛用于多個物種和靶標(biāo)的檢測。目前商用的細(xì)胞因子ELISA試劑盒大多采用雙抗體夾心法，能夠高特異性檢測復(fù)雜樣品中的分析物，靈敏度高，操作簡單方便，成本相對較低。但ELISA一次實驗僅能檢測一個靶標(biāo)，若需在同一樣品中檢測多個靶標(biāo)，操作多個ELISA較為復(fù)雜，時間花費長，且需要的樣本量較大，后面提到的多指標(biāo)分析技術(shù)可克服這些問題。另外，ELISA較窄的動態(tài)范圍，使得部分樣本需要稀釋，這樣可能會夸大樣本間的差異⁷。

檢測儀器平臺：酶標(biāo)儀
反應(yīng)容器：96或384孔板
可檢測種屬：人、小鼠、大鼠、非人靈長類、豬、狗、牛、羊等多個種屬
可檢測樣本類型：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等，不同的試劑盒適配的樣本類型不同。
所需樣本體積：50-100 µL
單次實驗可檢測指標(biāo)數(shù)：1
靈敏度：pg/ml
線性范圍：2-3 logs，常規(guī)ELISA線性范圍在10pg/ml-1000pg/ml，超敏試劑盒則為0.5-10pg/ml，不同試劑盒線性范圍不同。

實驗步驟

傳統(tǒng)ELISA
 

即用型ELISA詳細(xì)操作步驟，以Mouse IL-1β ELISA Kit（abs520034-96T）為例

1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封
5. 住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時;
6. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然
7. 后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10.   在每個微孔內(nèi)加入100uL SA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
11.   重復(fù)第5步洗板操作；
12.   在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
13.   在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。
14.   加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長。
15.   計算結(jié)果

非即用型ELISA需自行將捕獲抗體固定在孔板上，以下為抗體包被的詳細(xì)步驟，以Human IL-6 DuoSet ELISA（DY206-05）為例

1. 將捕獲抗體用不含載體蛋白的PBS稀釋至工作濃度。每孔加入100 μL稀釋后的捕獲抗體，進(jìn)行包被，密封后在室溫下孵育過夜。
2. 每孔吸棄液體并用洗滌緩沖液清洗，重復(fù)此過程兩次，總共洗滌三次。使用噴瓶、歧管分配器或自動洗板機(jī)將洗滌緩沖液 (400 μL) 注入每孔中進(jìn)行清洗。每一步需完全去除液體。最后一次洗滌后，吸棄或倒置微孔板并在干凈的紙巾上輕拍，去除剩余的洗滌緩沖液。
3. 每孔加入300 μL試劑稀釋液來封閉孔板。室溫下孵育至少1小時。
4. 重復(fù)第2步的吸棄/洗滌操作。

一步法ELISA 

傳統(tǒng)ELISA通常采用聚苯乙烯板，其疏水特性能夠與蛋白質(zhì)進(jìn)行非特異性結(jié)合，使蛋白質(zhì)能夠附著在其表面，從而固定捕獲抗體。然而，傳統(tǒng)的ELISA方法需要多次洗滌，操作時間（3-5小時）相對較長，而且多次清洗和孵育可能會導(dǎo)致分析物脫落⁵。

親和肽標(biāo)簽PS19（RAFIASRRIKRP）對親水性聚苯乙烯表面有特異性親和力，將此標(biāo)簽與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）進(jìn)行基因融合后，可以被優(yōu)先固定在親水性聚苯乙烯（phi-PS）板上，而不會受到共存蛋白質(zhì)分子的干擾⁵。另外，兔IgG與KPS19R10肽化學(xué)偶聯(lián)后，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力⁵。

基于這些發(fā)現(xiàn)，研究人員開發(fā)了一種使用帶有肽標(biāo)簽的phi-PS板和連接蛋白作為配體蛋白的一步法ELISA⁵。這種方法避免了傳統(tǒng)疏水性聚苯乙烯板（pho-PS）帶來的非特異性結(jié)合問題，可以減少洗滌和孵育步驟，避免了因清洗導(dǎo)致的分析物脫落。與傳統(tǒng)ELISA相比，一步法ELISA不僅顯著縮短了操作時間，還保持了高靈敏度。

優(yōu)寧維已上線多款OneStep ELISA試劑盒，僅需60分鐘即可完成實驗，包括IL-2/IL-6/IL-13/IFN-γ等指標(biāo)，指標(biāo)持續(xù)更新中，點此可查詢 

實驗步驟

圖：OneStep ELISA操作步驟簡要示意圖
 

OneStep ELISA詳細(xì)操作步驟，以 Human IL-2 OneStep ELISA Kit（abs551116-96T）為例

1. 使用前將需要所有材料和試劑平衡至室溫。建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品一式兩份做平行孔測試。
2. 準(zhǔn)備所有試劑、工作標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。
3. 從可拆卸的板框上去除多余的酶標(biāo)板條，將其放回含有干燥劑包裝的箔袋中，重新密封并返回2-8ºC儲存。
4. 取50μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加到相應(yīng)的孔中。
5. 每孔中加入50μL抗體對混合液.
6. 貼上封板膜，在設(shè)置條件為“轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘和溫度37°C”的  酶標(biāo)板恒溫振蕩器上孵育45分鐘。
7. 用300μL 1X Wash Buffer清洗每個孔，清洗三次。最后一次洗滌后，把板子倒過來，在干凈的紙巾上輕輕拍打數(shù)次，以去除多余的液體。
8. 每孔加入100μL TMB底物，在500轉(zhuǎn)/分的酶標(biāo)板恒溫振蕩器上避光顯色10分鐘。
9. 每孔加入100μL終止液，充分混勻后在30分鐘內(nèi)測定每個孔的OD450，使用設(shè)置為450nm的酶標(biāo)儀。
10.   結(jié)果計算

技術(shù)文章：
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講座：
ELISA實驗技術(shù)及常見問題分析 

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蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot, WB)
ELISA常用于檢測液體中的細(xì)胞因子，而WB更適用于分析細(xì)胞內(nèi)以及復(fù)雜生物樣本和組織中的細(xì)胞因子。在WB實驗中，變性蛋白首先在聚丙烯酰胺凝膠中分離，隨后被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或PVDF膜上，通過特異性抗體進(jìn)行檢測。雖然WB在檢測細(xì)胞因子時可能不如 ELISA 靈敏，但它可提供蛋白質(zhì)分子量信息，可區(qū)分剪接體或檢測細(xì)胞因子分子降解，也可區(qū)分無活性前體和活性形式，或者是檢測蛋白質(zhì)的磷酸化等各種翻譯后修飾。在檢測前進(jìn)行亞細(xì)胞組分分離（如核質(zhì)分離、線粒體提取等），還可分析靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

圖：WB檢測原理
 

檢測平臺：化學(xué)發(fā)光儀或熒光成像分析儀
反應(yīng)場所：NC膜或PVDF膜
單個樣本檢測指標(biāo)：1
可檢測樣本：細(xì)胞或組織裂解液
所需樣本量：10-150ug 總蛋白
靈敏度：pg~ng
數(shù)量級：無標(biāo)準(zhǔn)曲線，不可定量

實驗步驟

一、樣本準(zhǔn)備
1. 裂解提取組織或細(xì)胞中的蛋白，并且測定蛋白純度和濃度；
2. 蛋白溶液中加入適量蛋白上樣緩沖液，置于沸水/金屬浴中加熱5-10min，后轉(zhuǎn)移到冰上或者 4°C冰箱待用，短期可以保存于-20°C，長期請保存于-80'C。

二、SDS-PAGE膠的制備
3. 清洗玻璃板、梳子、制膠板和燒杯，晾干后裝備好制膠板;
4. 根據(jù)目的蛋白的大小按配方配制不同濃度的分離膠，以10ml10%的分離膠為例：先依次加入4.6mlH20、2.7ml30% Acrylamide、2.5 ml1.5M Tris-Hcl(pH8.8)和0.1ml10% SDS，再加入 0.1ml 10%過硫酸銨和0.006mI TEMED立即混勻后倒入模具中，加入約1cm蒸餾水封頂；
5. 室溫下30-60min待膠凝固后，倒去蒸餾水。按配方配制5%濃縮膠，以5ml為例：先依次加入3.4 ml H20、0.83ml 30% Acrylamide、0.63ml1.5M Tris-Hcl(pH6.8)和0.04ml 10% SDS,再加入0.04m10%過硫酸銨和0.005mI TEMED，混勻后立即倒入模具中，垂直插上梳子，注意不要有氣泡。

三、電泳
6. 室溫 30min 待膠凝固好后,將玻璃板固定在電泳橋中放入電泳槽，加入提前配制好的電泳液后，拔去梳子開始上樣，選用相應(yīng)蛋白分子量的 Marker，每個孔加入適量樣品，在旁邊空余的孔內(nèi)加入適量蛋白Marker；
7. 電壓調(diào)至80V，恒壓狀態(tài)開始電泳,約30min左右當(dāng) Marker條帶分開后調(diào)整電壓至 120V,繼續(xù)電泳,直到指示劑溴酚藍(lán)跑到凝膠最下端時，停止電泳。

四、轉(zhuǎn)膜
8. 準(zhǔn)備 PVDF 膜裁剪成合適大小并做好標(biāo)記，提前配置好 1X 快速轉(zhuǎn)膜緩沖液并預(yù)冷;
9. 用甲醇或者 PVDF 膜浸潤激活液浸泡活化 PVDF 膜 30-60s
10.   電泳結(jié)束后，按順序搭載轉(zhuǎn)膜裝置,將膠平整鋪在電轉(zhuǎn)夾上，將激活的PVDF膜覆蓋于膠上,保證膠和膜之間沒有氣泡。緩慢加入預(yù)冷的1X快速轉(zhuǎn)膜緩沖液,將轉(zhuǎn)膜夾固定好后放入電轉(zhuǎn)儀中,將電泳儀至于冰水混合物中,并且電泳儀內(nèi)部需加入冰袋;
11.   電流 200-250mA，恒流狀態(tài),根據(jù)分子量大小設(shè)置轉(zhuǎn)膜時間,開始電轉(zhuǎn)。

五、封閉
12.   轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,先放入TBST漂洗一遍,去除膜表面的轉(zhuǎn)膜液。再將PVDF膜轉(zhuǎn)移到膜盒中，加入快速封閉液，室溫輕搖15-30min(或使用5%脫脂奶粉溶液封閉 1h)。

六、免疫檢測
13.   倒去封閉液，TBST在搖床上快速清洗三次,10 min/次。加入稀釋好的一抗,室溫?fù)u床慢速孵育 2 小時或者 4°C過夜；
14.   TBST快速清洗三次，10min/次。加入稀釋好的二抗,室溫?fù)u床慢速搖晃孵育 1-2 h;
15.   棄去二抗，TBST 快速清洗三次，10min/次。

七、顯影
16.   將顯影液 A和 B等比例混合配成工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；
17.   把PVDF膜放在水平桌面上的保鮮膜上，在膜表面加入工作液，并使工作液完全覆 PVDF 膜,反應(yīng)30-60s;
18.   取出PVDF膜，吸干多余的液體，放入化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行蛋白顯影分析。

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免疫印跡（WB）實驗流程及常見問題解答 

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時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）
樂備實可提供檢測服務(wù)

TR-FRET 是一種將時間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）相結(jié)合的技術(shù)。

圖：THUNDER^TM TR-FRET技術(shù)原理圖
 

在FRET中，不同生物分子分別被標(biāo)記上供體或受體熒光團(tuán)。當(dāng)生物分子相互作用時，供體和受體熒光基團(tuán)靠近。此時，當(dāng)供體被激發(fā)后，它可以將其發(fā)射能量轉(zhuǎn)移給受體，受體進(jìn)而發(fā)射特定波長的熒光。供體和受體的熒光發(fā)射波長不同，可通過儀器檢測，從而實現(xiàn)對生物分子相互作用的定量分析。銪-藻藍(lán)蛋白（Eu-APC 或 Eu-XL665）和鋱-PE（Tb-PE）是兩種常見的供體-受體對。Eu 的峰值激發(fā)/發(fā)射在 340/615 nm，而 APC 的峰值激發(fā)/發(fā)射在 615/660 nm。

圖：FRET原理
 

時間分辨熒光（TRF）通過使用長壽命熒光的鑭系元素?zé)晒鈭F(tuán)來降低背景信號。這種長壽命熒光持續(xù)數(shù)毫秒，因此，通過脈沖光源（例如閃光燈）激發(fā)熒光基團(tuán)后，延遲一段時間再進(jìn)行信號測量（即“計數(shù)窗口”），可以使僅存續(xù)納秒的短壽命的熒光衰減后再進(jìn)行測量。時間分辨熒光（TRF）能夠顯著提高信噪比。最常使用的鑭系元素包括銪、鋱和釤。這些元素通常以螯合物或籠狀化合物的形式應(yīng)用，以確保良好的信號強(qiáng)度和穩(wěn)定性。

圖：TRF原理
 

TR-FRET 通常用于分析分子間的相互作用，在檢測細(xì)胞因子時，供體和受體通常是能識別同一個細(xì)胞因子不同抗原表位的抗體對。一種抗體用供體熒光團(tuán)（銪穴合物）標(biāo)記，而另一種抗體用受體熒光團(tuán)（APC、ULight 或 d2）標(biāo)記。它們特異性地與分析物結(jié)合，但結(jié)合位點不同，從而使供體和受體熒光集團(tuán)靠近，實現(xiàn) FRET²。

TR-FRET的時間分辨特性和近距離激發(fā)信號可以排除樣本內(nèi)其他成分的背景熒光，使其成為無需清洗的均相檢測方法。其數(shù)據(jù)分析采用的是受體/供體熒光的比值，可進(jìn)一步減少非特異性信號。由于以上種種優(yōu)點，TR-FRET已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)，包括高通量篩選。

不過，由于TR-FRET涉及三個基本成分（供體、分析物和受體）之間的復(fù)雜物理特性，這三種成分的濃度和比例會顯著影響信號，實驗需要進(jìn)行大量優(yōu)化。FRET要求的近距離（20-90 Å）也給尋找合適的供體-受體對帶來挑戰(zhàn)²。

儀器平臺：安裝有TR-FRET模塊的酶標(biāo)儀
反應(yīng)容器：96 、384 或 1536 孔板，推薦使用淺孔板
單孔檢測指標(biāo)數(shù)：1
檢測樣本種屬：人、小鼠、大鼠、豬
可檢測樣本類型：細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清
樣本體積：樣本體積15ul，整個反應(yīng)體系僅20ul
靈敏度：pg/ml
線性范圍：4 logs
特點：

1. 操作簡單、快速：均相檢測技術(shù)，無需洗板和包被，只需兩步加樣即檢測，1-2h快速檢測；
2. 反復(fù)讀板，信號穩(wěn)定：實驗體系可支持反復(fù)讀值，過夜、48h后讀值亦可； 
3. 節(jié)省樣本：實驗體系為20μl，樣本僅需15μl；
4. 超高通量：兼容94孔，384孔和1536孔微孔板。

實驗步驟
 

詳細(xì)操作步驟，以THUNDER™mouse IFNγ assay（KIT-MIFNG-100）為例

1. 準(zhǔn)備緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及抗體等
2. 向孔板中添加15 µL標(biāo)準(zhǔn)品工作液或 15 µL 細(xì)胞上清液樣品 
3. 向每個檢測孔中添加 5 μL 4X 抗體檢測混合物 (Eu-Ab1 + FR-Ab2)
4. 密封膜蓋住孔板，室溫孵育 1 小時
5. 輕輕取下密封膜，在兼容TR-FRET 的微孔板讀數(shù)儀上讀取數(shù)據(jù)

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多指標(biāo)檢測技術(shù)
液相懸浮芯片技術(shù)Luminex
樂備實可提供檢測服務(wù)

與ELISA類似，Luminex技術(shù)也使用雙抗體夾心法，其關(guān)鍵創(chuàng)新在于將抗體固定在微球表面。由于微球表面可包被大量抗體，因此大大增加了反應(yīng)的表面積，提高了檢測的靈敏度。
 

圖：Luminex檢測原理⁴
 

通過使用兩種或三種不同的染料，并以不同比例對微球進(jìn)行染色，可產(chǎn)生多達(dá)100種或500種不同顏色的微球。每種顏色的微球都具有獨特的編碼，并且只固定包被一種抗體，從而實現(xiàn)了編碼與靶標(biāo)的一一對應(yīng)。由于微球是液態(tài)的，可將多種不同編碼的微球混合在一起，放入同一個孔中。加入樣本和檢測抗體后，即可在一個樣本中同時檢測多種蛋白質(zhì)。

圖：Luminex多色微球
 

圖：Luminex如何實現(xiàn)多指標(biāo)檢測

以同樣檢測20個指標(biāo)為例比較Elisa和Luminex的不同，可見當(dāng)樣本量有限但需要檢測的靶標(biāo)眾多時，Luminex技術(shù)更高效、更節(jié)省樣本，且性價比更高，是目前應(yīng)用最為廣泛的多指標(biāo)檢測技術(shù)之一。

檢測平臺：Luminex200、FLEXMAP 3D、MAGPIX
反應(yīng)容器：96或384孔板
單孔可檢測指標(biāo)數(shù)：1~115
樣本種屬：人、小鼠、大鼠、非人靈長類、犬、貓、牛、馬、豬、雞、羊
可檢測樣本類型：血清、血漿、細(xì)胞上清、尿液、組織裂解液、乳汁、唾液、房水、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等多種樣本類型
所需樣本體積：25-50μL
靈敏度：pg/ml
線性范圍：3.5- 5.5 logs

實驗步驟：
 

詳細(xì)實驗流程，以Human Luminex® Discovery Assay（LXSAHM）為例

1. 準(zhǔn)備所有試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。
2. 向每孔加入 50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。
3. 通過倒置或渦旋振蕩來重懸稀釋后的微球混合物。每孔中加入 50 μL微球混合物。用箔紙密封板。在設(shè)定轉(zhuǎn)速為 800 ± 50 rpm 的水平軌道微孔板搖床上，室溫孵育 2 小時。
4. 使用磁力洗板機(jī)進(jìn)行清洗，將磁鐵置于微孔板底部，等待 1 分鐘后移除液體，向每孔加入 100 μL洗滌緩沖液，并再次等待 1 分鐘后移除液體。重復(fù)此清洗步驟三次。
5. 向每孔加入 50 μL稀釋后的生物素-抗體混合物。用箔紙密封板，并在設(shè)定轉(zhuǎn)速為 800 ± 50 rpm 的搖床上，室溫孵育 1 小時。
6. 如步驟 4 所述重復(fù)清洗。
7. 向每孔加入 50 μL稀釋后的鏈霉親和素-PE。用箔紙密封板，并在設(shè)定轉(zhuǎn)速為 800 ± 50 rpm 的搖床上，室溫孵育 30 分鐘。
8. 如步驟 4 所述重復(fù)清洗。
9. 每孔加入 100 μL洗滌緩沖液重懸微珠。在設(shè)定轉(zhuǎn)速為 800 ± 50 rpm 的搖床上孵育 2 分鐘。
10.   在 90 分鐘內(nèi)使用 Luminex®分析儀讀取結(jié)果。

實驗指南
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講座
Luminex原理、同類技術(shù)比較及高分文獻(xiàn)解析
沒有儀器平臺，害怕操作失誤？不用擔(dān)心，您只需提供樣本，樂備實Labex幫您一站式全搞定，目前多款細(xì)胞因子檢測服務(wù)正在大促中，點此查看詳情 

Cytometric Bead Array（CBA）
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與前述Luminex技術(shù)類似，CBA也是基于微球的檢測方法。不同的是CBA實現(xiàn)多個因子同時檢測是利用了流式細(xì)胞儀可以識別同一種熒光素不同強(qiáng)度的特點。

將每種微球表面包被特定細(xì)胞因子的捕獲抗體，通過流式細(xì)胞儀對微球和檢測抗體上PE的熒光的強(qiáng)度進(jìn)行分析，從而可以同時定量檢測30種分析物。

儀器平臺：流式細(xì)胞儀
反應(yīng)容器：流式管
單管檢測指標(biāo)數(shù)：1~30
樣本種屬：人、小鼠、大鼠、狒狒、獼猴、恒河猴、牛、豬
可檢測樣本類型：血漿、血清、培養(yǎng)上清、淚液、體液、鼻腔沖洗液、細(xì)胞裂解液等液態(tài)樣本
樣本體積：25-50μL
靈敏度：常規(guī)10 pg/mL，高敏系列0.274pg/mL
線性范圍：3-4 logs

實驗步驟：
 

圖：CBA的檢測原理與實驗流程
 

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常見多因子檢測技術(shù)原理及應(yīng)用

抗體芯片
樂備實可提供檢測服務(wù)

抗體芯片是檢測蛋白的一種技術(shù)，包括雙抗體夾心檢測和直接檢測兩種形式。膜芯片通常是半定量的，采用化學(xué)發(fā)光或熒光檢測，實驗操作類似Western Blot，但不需電泳和轉(zhuǎn)膜步驟。玻璃芯片通常是定量的，使用熒光檢測?？贵w芯片可同時檢測多達(dá)1,200 種人類蛋白、640 種小鼠蛋白或 67 種大鼠蛋白，主要用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤及其他疾病的相關(guān)研究。抗體芯片單次實驗檢測的樣本數(shù)量較少，以R&D公司的Proteome Profiler系列產(chǎn)品為例，一個試劑盒檢測4個樣品，更適合做樣品數(shù)量較少的多指標(biāo)篩選。 

儀器平臺：膜芯片用化學(xué)發(fā)光儀，玻璃芯片需用玻璃芯片掃描儀
反應(yīng)容器：膜或玻璃芯片
單張芯片可定量檢測指標(biāo)數(shù)：人類蛋白≤1200，小鼠蛋白≤640，大鼠蛋白≤67
檢測種屬：人、小鼠、大鼠、豬、牛、馬、犬、兔、綿羊、貓、恒河猴、雞、海豚
可檢測樣本：細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞組織裂解液、血清、血漿等
樣本體積：定量芯片50-100ul
靈敏度：~pg/ml

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常見多因子檢測技術(shù)原理及應(yīng)用 

超靈敏多指標(biāo)檢測技術(shù)
電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)Meso-scale Discovery (MSD)
樂備實可提供檢測服務(wù)

MSD超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)由美國Meso Scale Discovery公司研發(fā)。 與傳統(tǒng)的ELISA相似，MSD也是通過雙抗體夾心法來定量目標(biāo)蛋白。但其獨特之處在于其采用了石墨烯材質(zhì)的電極板作為反應(yīng)容器，這種材質(zhì)能顯著增加捕獲抗體的固載量。同時利用SULFO-TAG（三聯(lián)吡啶釕）替代傳統(tǒng)的酶或熒光染料標(biāo)記在檢測抗體上，當(dāng)電極板通電時，SULFO-TAG發(fā)生一系列氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生光信號，隨后被儀器內(nèi)的CCD相機(jī)捕獲。MSD是電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程的完美結(jié)合，可將許多非特異信號予以排除，受樣本性質(zhì)的影響更小，對于各類生物學(xué)樣本的兼容度高。

圖：MSD檢測原理
 

MSD的一大特點是超高的靈敏度及更寬的線性范圍，它的靈敏度之所以可達(dá)到飛克級別，主要原因有以下幾個方面：
1、石墨烯底板：其單位面積的抗體包被量較常規(guī)材質(zhì)孔板提高約10倍
2、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)：
MSD 以SULFO-TAG（三聯(lián)吡啶釕) 作為發(fā)光基質(zhì)，其分子量約為1000Da（約為HRP的1/40），空間位阻小，易于標(biāo)記抗體，且不易阻礙其與待測物質(zhì)的結(jié)合；當(dāng)電極板通電時，三聯(lián)吡啶釕上的釕元素會發(fā)生一系列氧化還原反應(yīng)，循環(huán)反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行并釋放出光子，該光信號在620nm處發(fā)射，較熒光更穩(wěn)定，不易淬滅；
3、包被方式： S-PLEX試劑盒孔板包被的是鏈霉親和素，將其與生物素抗體結(jié)合。由于鏈霉親和素與生物素有極高的親和性，一個鏈霉親和素可同時結(jié)合四個生物素分子，使得抗體包被量被大大提高。

目前，MSD技術(shù)在免疫學(xué)、疾病研究和藥物開發(fā)等多個領(lǐng)域均得到了廣泛應(yīng)用。特別是在神經(jīng)退行性疾病的研究中，MSD已成為aβ 38、40、42等蛋白檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，僅需10微升的樣本量即可定量檢測這些分析物。此外，MSD還提供了包括α-Synuclein、APP、NFL、NFH、Tau（total）、VEGF-A、GFAP以及不同磷酸化位點的Tau（如pT181、pT231、pT217）等在內(nèi)的多種神經(jīng)相關(guān)指標(biāo)的檢測產(chǎn)品，為科研人員提供了有力的研究工具。

檢測儀器平臺：MSD S120/MSD S600
反應(yīng)容器：石墨烯材質(zhì)的96或384孔電極板
單孔可檢測指標(biāo)數(shù)：1-10
檢測種屬：人、小鼠、大鼠、非人靈長類、犬
可檢測樣本類型：血清、血漿、腦脊液、尿液、細(xì)胞上清、組織裂解液、乳汁、唾液、房水、支氣管肺泡灌洗液等多種樣本
所需樣本體積：10-25μL
靈敏度：可達(dá)fg/ml
線性范圍：3–6 logs，線性范圍更寬

實驗步驟：

1.清洗并加入樣品 
用至少150ul/孔的洗滌緩沖液清洗酶標(biāo)板三次。 
每孔加入50 ul準(zhǔn)備好的樣品、校準(zhǔn)品或?qū)φ掌贰?br /> 用粘性封板膜密封酶標(biāo)板，并在室溫下?lián)u動孵育2小時。 

2.清洗并加入檢測抗體溶液 
用至少150 ul /孔的洗滌緩沖液清洗酶標(biāo)板三次。 
每孔加入25 ul檢測抗體溶液。用粘性封板膜密封酶標(biāo)板，并在室溫下?lián)u動孵育2小時。 

3.清洗并讀數(shù) 
用至少150 ul /孔的洗滌緩沖液清洗酶標(biāo)板三次。 
每孔加入150 ul的2X讀數(shù)緩沖液T。
使用MSD儀器分析酶標(biāo)板。

應(yīng)用：
1. 神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌疾病、腫瘤免疫治療等研究
2. Biomarker篩選
3. 藥物免疫原性評估、抗體藥物篩選、疫苗開發(fā)等

實驗指南
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優(yōu)寧維提供MSD儀器、試劑及服務(wù)，多款MSD檢測服務(wù)正在大促中，點此查看詳情 

鄰近延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）
樂備實可提供檢測服務(wù)】

PEA使用一對與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體，每個抗體都連接有一個獨特的DNA序列。當(dāng)兩個抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合時，它們的DNA序列會靠近，通過DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸和擴(kuò)增，最終通過實時定量PCR（qPCR）或二代測序（NGS）檢測DNA信號，實現(xiàn)對目的蛋白的分析。PEA已被Olink®公司商業(yè)化，提供Explore HT（5300個指標(biāo)）、Explore（384/3072個指標(biāo)）、Target（48/96個指標(biāo)）、Flex（半定制）、Focus（定制）系列試劑盒，一周最高可檢測2064個樣本，其中Target48/Flex/Focus系列可提供定量結(jié)果（pg/ml），其他則可提供相對定量的NPX值（Normalized Protein eXpression，均一化蛋白表達(dá)）。Olink®技術(shù)以其多指標(biāo)、高通量、極微量樣本及超高靈敏度的優(yōu)勢，在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病機(jī)理研究、藥物開發(fā)、臨床診斷和人群健康研究等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。

檢測平臺：Olink® Signature Q100或二代測序儀
反應(yīng)容器：96孔板
單孔檢測指標(biāo)：48~5400+
可檢測種屬：人、小鼠
可檢測樣本：血漿，血清，組織裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)液、腦脊液、尿液、房水等多種體液樣本
所需樣本量：1-6ul
靈敏度：fg/ml
線性范圍：10 logs，fg-mg/mL

單分子陣列（Single Molecular Array，Simoa®）

Simoa®技術(shù)是一種用于檢測極低濃度蛋白質(zhì)的高靈敏度技術(shù)。它將樣本中的目的蛋白捕獲到含有特異性抗體的微珠（直徑2.7μm）上，并將這些微珠分布在微流控芯片中的238000個小孔（nanowell）內(nèi)。每個小孔體積非常小，直徑僅4.5μm，體積約 40 fl 左右。將免疫復(fù)合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對熒光點進(jìn)行計數(shù)，依據(jù)泊松分布理論，計算同時含珠子與熒光產(chǎn)物孔的數(shù)量/含珠子孔總數(shù)的比值，以此確定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。Simoa® 的整個實驗流程（包括樣本稀釋，試劑添加，孵育，洗滌，檢測和分析等所有環(huán)節(jié)）均由專用儀器平臺完成，降低了手工操作的誤差，單次實驗最多可檢測10 個指標(biāo)，比傳統(tǒng)ELISA靈敏度提高1000倍以上，檢測限低至1 fg/mL6。目前，Simoa®廣泛應(yīng)用在神經(jīng)性疾病、腫瘤檢測、傳染性疾病等研究中。

實驗平臺：Simoa專用儀器
反應(yīng)容器：96孔板或樣本管
單次實驗檢測指標(biāo)：≤10個 
可檢測種屬：人、小鼠、大鼠、非人靈長類、牛、豬
可檢測樣本：血漿，血清，腦脊液、眼淚、細(xì)胞培養(yǎng)上清等多種生物樣本
所需樣本量：1ul-100 ul，平均25 ul 
靈敏度：fg/ml
線性范圍：2.5~4+ logs

單細(xì)胞水平的細(xì)胞因子檢測
酶聯(lián)免疫斑點實驗(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISpot)
樂備實可提供檢測服務(wù)

常見的免疫檢測方法通常僅可檢測由大量細(xì)胞產(chǎn)生、釋放到組織或各類體液中的細(xì)胞因子，或是體外培養(yǎng)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，測得的是細(xì)胞的平均反應(yīng)，無法檢測某類細(xì)胞亞群（如抗原特異性 T 細(xì)胞或 B 細(xì)胞）的細(xì)胞因子分泌情況。ELISpot則可以在單細(xì)胞水平對抗體分泌細(xì)胞(ASC)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測。首先，將細(xì)胞孵育在包被有捕獲抗體的多孔板上，該抗體可捕獲分泌的細(xì)胞因子。去除細(xì)胞后，加入檢測抗體，通過顯色反應(yīng)或熒光觀察細(xì)胞因子的產(chǎn)生。每個產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞位置都顯示為一個斑點。通過 ELISpot讀板儀對斑點進(jìn)行計數(shù)和分析。統(tǒng)計膜上的斑點數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，即可以計算出陽性細(xì)胞的百分比。

目前，ELISpot的主要應(yīng)用在以下領(lǐng)域：

1. 免疫學(xué)基礎(chǔ)研究（T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞，Th0/Th1/Th2 細(xì)胞分析）：ELISpot可用來區(qū)分被激活的不同T細(xì)胞亞群。例如Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ,IL-2 和TNF-α，而Th2細(xì)胞分泌IL-4,IL-5和IL-13等。
2. 疫苗研究：ELISpot是檢測和評價疫苗的細(xì)胞免疫水平的國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)工具，已廣泛用于疫苗的研制和評估。
3. 腫瘤免疫研究和免疫治療/細(xì)胞治療：用于檢測腫瘤抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
4. 感染性疾病研究與診斷：第一個被SFDA 批準(zhǔn)的基于ELISpot法的診斷平臺（T-SPOT.TB）已上市，此外，ELISpot還可用于其他感染性疾病如HBV,HCV等的抗感染免疫研究與診斷。
5. 自身免疫疾病研究：如I型糖尿病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病病因分析、預(yù)測、早期診斷、指導(dǎo)治療以及預(yù)后分析等。
6. 其他：藥物篩選、移植免疫研究等，適用于任何想要在單細(xì)胞水平研究蛋白分泌的實驗。

檢測平臺：ELISpot Reader
反應(yīng)容器：ELISpot 多孔板（通常是96孔板）
單次實驗檢測指標(biāo)：ELISpot檢測單個指標(biāo)，F(xiàn)luoroSpot最高可測7種
可檢測樣本：人或動物的PBMC、脾細(xì)胞、其他類型的免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞等
靈敏度：1 in 100,000 cells

實驗步驟：以Mouse IFN-gamma ELISpot Kit（EL485）為例

1. 在每孔中加入用200 μL無菌培養(yǎng)基，室溫孵育20分鐘。
2. 吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)基，立即向每孔中加入100 μL相應(yīng)的細(xì)胞或?qū)φ铡?br /> 3. 在濕潤的37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞。每個刺激的最佳孵育時間應(yīng)由研究者確定。在孵育期間不要擾動細(xì)胞。
4. 吸出每個孔中的液體并清洗，整個過程重復(fù)三次共四次清洗。使用擠壓瓶、歧管分配器或自動洗板機(jī)向每孔中加入250-300 μL的洗滌緩沖液進(jìn)行清洗。最后一次清洗后，移除剩余的洗滌緩沖液。將板倒置并在干凈的紙巾上輕拍。 
5. 每孔中加入100 μL稀釋的檢測抗體混合物，2-8°C過夜孵育。或在搖床上室溫孵育2小時。
6. 重復(fù)步驟4中的清洗程序。
7. 每孔中加入100 μL稀釋的鏈霉親和素-堿性磷酸酶濃縮液A，室溫孵育2小時。
8. 重復(fù)步驟4中的清洗程序。
9. 向每個孔中加入100 μL的BCIP/NBT底物，室溫避光孵育1小時。
10.   去除孔板中的BCIP/NBT底物溶液，用去離子水沖洗微孔板。將微孔板倒置輕敲以去除多余水分。從微孔板底部移除柔性塑料排水裝置，用紙巾徹底擦干板底并完全晾干（室溫下60-90分鐘或37°C下15-30分鐘）。

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流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FCM）
樂備實可提供檢測服務(wù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的技術(shù)，它通過測量細(xì)胞的物理和化學(xué)特性來對細(xì)胞進(jìn)行快速、高通量的分析和分選。基于單細(xì)胞分析，可檢測表達(dá)細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率，并通過對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行染色來表征特定細(xì)胞群。流式細(xì)胞術(shù)能進(jìn)行多參數(shù)分析，分析參數(shù)的數(shù)量與細(xì)胞群、目標(biāo)細(xì)胞因子和流式細(xì)胞儀相關(guān)。但并非所有細(xì)胞因子都能通過單一方案檢測到，檢測低表達(dá)或新鑒定的細(xì)胞因子可能需要對染色進(jìn)行嚴(yán)格優(yōu)化。此外，細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞因子并不一定意味著它會從細(xì)胞中釋放出來或在體內(nèi)表現(xiàn)出生物學(xué)效應(yīng)³。

檢查平臺：BD FACS Celesta等流式檢測平臺
樣本類型：心臟、肝、肺、脾、腫瘤、腸、皮膚、血液等樣本

流式多色配色工具，點此進(jìn)入

流式實驗操作步驟，點此查看

優(yōu)寧維提供完整的流式細(xì)胞術(shù)解決方案，包含儀器、試劑、耗材及服務(wù)，點此查看

質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（Mass cytometry，CyTOF）
質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（也稱為CyTOF）是一種將流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜法相結(jié)合的單細(xì)胞分析技術(shù)。該方法理論上每秒可對多達(dá)3000個細(xì)胞進(jìn)行實時定量單細(xì)胞分析，并可以同時測量一個細(xì)胞中的60種不同標(biāo)記物（蛋白質(zhì)或其他生物分子）。與傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)一樣，細(xì)胞被特異性抗體染色，但這些抗體與元素標(biāo)簽（金屬的穩(wěn)定同位素）而不是熒光染料結(jié)合。細(xì)胞分析由電感耦合等離子體飛行時間質(zhì)譜儀（ICPTOF-MS）進(jìn)行。與基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)相比，該技術(shù)的主要優(yōu)勢是分辨率高、靈敏度高，可以同時測量大量標(biāo)記物，而且不需要補(bǔ)償發(fā)射光譜重疊。然而，該技術(shù)無法進(jìn)行細(xì)胞分選，而且結(jié)果的質(zhì)量控制和統(tǒng)計分析也具有挑戰(zhàn)性³。

優(yōu)寧維提供多款CyTOF抗體，點擊此處查看詳情

質(zhì)譜（Mass spectrometry ，MS ）
質(zhì)譜（MS）是蛋白質(zhì)組學(xué)的一項基本技術(shù)，用于蛋白質(zhì)的鑒定和定量。在經(jīng)典的自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中，蛋白質(zhì)先被分離并用酶（如胰蛋白酶）消化成肽段，之后肽段經(jīng)過濃縮、脫鹽、高效液相色譜（HPLC）分離，再通過質(zhì)譜分析。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測量肽段的質(zhì)荷比及其片段離子，實現(xiàn)對肽段/蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性的鑒定和定量。

然而，質(zhì)譜在細(xì)胞因子檢測中面臨若干挑戰(zhàn)。首先，質(zhì)譜僅能檢測帶電荷的肽，而不同肽的離子化效率存在差異。其次，細(xì)胞因子等低分子量蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽段少，并且在復(fù)雜的生物樣本中含量極低，因此在沒有適當(dāng)?shù)母患襟E下難以檢測。此外，盡管質(zhì)譜技術(shù)具有高重復(fù)性和特異性，但由于其對低豐度蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子的檢測靈敏度有限，通常需要樣品預(yù)處理。蛋白質(zhì)鑒定過程依賴于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，這在非人類物種的研究中可能不夠全面。總的來說，與免疫學(xué)方法相比，質(zhì)譜技術(shù)在靈敏度上可能有所不足³。

常用細(xì)胞因子檢測方法比較

細(xì)胞因子的檢測方法眾多，每種方法各有優(yōu)劣勢，科研人員需根據(jù)樣本種屬、指標(biāo)、樣本體積、數(shù)量、儀器平臺及價格等挑選適合的技術(shù)，也可聯(lián)系小優(yōu)為您推薦合適的方案。優(yōu)寧維提供完整的細(xì)胞因子檢測解決方案，包含儀器、試劑耗材及服務(wù)，為您的科研保駕護(hù)航。

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1.Stenken JA, Poschenrieder AJ. Bioanalytical chemistry of cytokines--a review. Anal Chim Acta. 2015 Jan 1;853:95-115.
2.Platchek M, Lu Q, Tran H, Xie W. Comparative Analysis of Multiple Immunoassays for Cytokine Profiling in Drug Discovery. SLAS Discov. 2020 Dec;25(10):1197-1213.
3.Kupcova Skalnikova H, Cizkova J, Cervenka J, Vodicka P. Advances in Proteomic Techniques for Cytokine Analysis: Focus on Melanoma Research. Int J Mol Sci. 2017 Dec 13;18(12):2697. 
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