在生物醫(yī)學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域中，細(xì)胞活性檢測扮演著至關(guān)重要的角色。它不僅幫助科學(xué)家們評估細(xì)胞的生存狀態(tài)，還能深入了解細(xì)胞對藥物、環(huán)境變化或病理過程的響應(yīng)。細(xì)胞活性檢測通常包括測量細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡等方面。今天，小愛向大家介紹細(xì)胞活性檢測的六大常用方法：ATP生物發(fā)光法、LDH檢測法、MTT比色法、CCK-8法、熒光染料法和細(xì)胞凋亡檢測法，一起揭秘細(xì)胞活力的科學(xué)奧秘。
ATP生物發(fā)光法
細(xì)胞內(nèi)ATP（腺苷三磷酸）的含量是細(xì)胞能量代謝的直接指標(biāo)。ATP生物發(fā)光法通過測量細(xì)胞內(nèi)ATP的水平來評估細(xì)胞活性。這種方法具有高靈敏度和寬動態(tài)范圍，尤其適合于需要高靈敏度檢測的實驗。
圖1. ATP檢測試劑盒（abs580117）檢測細(xì)胞活性的原理圖。
ATP生物發(fā)光法的主要原理是在有氧環(huán)境下，熒光素在熒光素酶和Mg2+的催化作用下與ATP發(fā)生反應(yīng)，生成熒光素-AMP復(fù)合體并釋放出焦磷酸（PPi）。隨后，熒光素-AMP復(fù)合體在O2的作用下進(jìn)一步生成氧化熒光素，同時釋放出CO2和H2O。在這個過程中，激發(fā)態(tài)的氧化熒光素返回到基態(tài)時會發(fā)出光子，光子的數(shù)量與ATP含量成正比，因此可以通過測量光強度來定量ATP的含量。
LDH檢測法
乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）是一種廣泛存在于細(xì)胞中的酶，它在糖酵解途徑中起著關(guān)鍵作用，能夠催化乳酸和丙酮酸之間的可逆反應(yīng)。LDH 催化乳酸產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，顏色的深淺與丙酮酸的濃度呈正比，通過測定 OD 值，可計算 LDH 的活力。在細(xì)胞活性檢測中，LDH的釋放通常被用作細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞膜受損時，細(xì)胞內(nèi)的LDH會釋放到培養(yǎng)基中，通過測定培養(yǎng)基中LDH的活性，可以評估細(xì)胞的損傷或死亡程度。
MTT比色法
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）比色法是一種經(jīng)典的細(xì)胞活性檢測方法。它通過測量活細(xì)胞中脫氫酶的活性，將MTT還原成紫色的甲瓚產(chǎn)物，從而間接反映細(xì)胞的代謝活性。這種方法操作簡單，成本低廉，是實驗室中常用的篩選工具。
CCK-8法
CCK-8（Cell Counting Kit-8）法是一種基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑單鈉鹽）的比色方法。它通過測量細(xì)胞線粒體脫氫酶的活性來評估細(xì)胞活性。CCK-8法具有較高的靈敏度和較寬的動態(tài)范圍，適合于各種細(xì)胞類型的活性檢測。
熒光染料法
熒光染料法利用特定的熒光染料，如Calcein-AM或CFSE，來標(biāo)記活細(xì)胞。這些染料在活細(xì)胞內(nèi)被代謝成熒光產(chǎn)物，通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。熒光染料法可以提供直觀的細(xì)胞活力圖像，適用于細(xì)胞增殖和遷移研究。
細(xì)胞凋亡檢測
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，與細(xì)胞活性密切相關(guān)。通過Annexin V和PI（碘化丙啶）染色，可以檢測細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸外化，從而評估細(xì)胞凋亡的程度。這種方法對于研究細(xì)胞死亡機制和藥物毒性具有重要意義。
細(xì)胞活性檢測六大常用方法優(yōu)缺點比較
ATP生物發(fā)光法
靈敏度高，能快速檢測細(xì)胞活性，操作簡便，直接反映細(xì)胞的代謝活性，與細(xì)胞數(shù)量成正比。
可能受到樣品中其他ATP來源的干擾，如微生物污染。
LDH檢測法
比色法操作簡便快速，標(biāo)準(zhǔn)曲線法精確定量，靈敏度高，適用于多種細(xì)胞類型，反映細(xì)胞膜完整性，也可以用來評估細(xì)胞毒性。
可能受到樣品中其他LDH來源的干擾，如微生物污染。只能反映細(xì)胞死亡，不能直接反映細(xì)胞增殖。
MTT比色法
成本較低，操作簡單，適用于多種細(xì)胞類型。能夠反映細(xì)胞的代謝活性，尤其是線粒體的活性。
需要活細(xì)胞參與，死亡細(xì)胞無法進(jìn)行檢測。需要較長的孵育時間，實驗周期較長。
CCK-8法
操作簡便，靈敏度高。適用于各種細(xì)胞類型，包括懸浮細(xì)胞。能夠反映細(xì)胞增殖和活力。
相對于MTT，CCK-8的成本可能較高。對某些細(xì)胞類型可能存在毒性。
熒光染料法
可以實時監(jiān)測細(xì)胞活性，適合長時間跟蹤實驗。如Calcein-AM可以被活細(xì)胞中的酯酶切割產(chǎn)生熒光，從而指示細(xì)胞活性。
熒光染料可能對細(xì)胞有一定的毒性，尤其是在高濃度或長時間染色時。此外，熒光信號可能會受到光漂白的影響。
細(xì)胞凋亡檢測法
可以特異性地檢測細(xì)胞凋亡，如通過Annexin V和PI染色，可以區(qū)分早期和晚期凋亡細(xì)胞。
需要特定的試劑和設(shè)備，如流式細(xì)胞儀，操作相對復(fù)雜，成本較高。
每種方法都有其特定的應(yīng)用場景和限制，選擇合適的檢測方法需要根據(jù)實驗的具體需求和條件來決定。
下面小愛著重為大家介紹具有高靈敏度、操作簡便、快速等優(yōu)點的ATP檢測法。
ATP檢測試劑盒（abs580117）使用方法
一、產(chǎn)品組成
二、使用方法
1、需自備的試劑和器材：
⑴ 細(xì)胞培養(yǎng)用pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）
⑵ Triton X-100
⑶ 系列可調(diào)節(jié)量程移液器及吸頭
⑷ 離心管及白色96孔板
⑸ 化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀
2、實驗前準(zhǔn)備
⑴ 樣品準(zhǔn)備：
①細(xì)胞培養(yǎng)上清的準(zhǔn)備：將需要測定的細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，經(jīng)過干預(yù)因素處理后，直接吸取細(xì)胞上清，如果是懸浮細(xì)胞，4℃、300 g離心5分鐘，收集上清。
②細(xì)胞裂解上清的準(zhǔn)備：將需要測定的細(xì)胞(1×106-1×107)收集到5mL的離心管中，4℃、300 g離心5分鐘，棄去上清，然后加入200μL含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴裂解30分鐘，4℃、10000 g離心10分鐘，收集上清。
③組織裂解上清的準(zhǔn)備：將需要測定的組織(20-50 mg)收集到玻璃勻漿器或自動勻漿管中，然后加入500μL含1%Triton X-100的PBS，勻漿1分鐘，4℃、10000 g離心10分鐘，收集上清。注：各種樣品，如果不立即進(jìn)行測定，請凍存于-80℃；正式測定前根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，利用ATP Assay Buffer將樣品適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。
⑵ 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：
在1.5mL離心管中，加入990μL ATP Assay Buffer，再取10μL的100μM濃度ATP Standard加入離心管中配制1μM濃度ATP Standard；然后取另外8根1.5mL離心管，分別加入200μL ATP Assay Buffer，再吸取200μL的1μM濃度ATP Standard依次倍比稀釋為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039μM濃度。
⑶ 檢測工作液的準(zhǔn)備：
ATP檢測工作液的配制：根據(jù)待測樣品數(shù)參考下表配制適當(dāng)量的ATP檢測工作液，表中試劑按比例混合后即為ATP檢測工作液。
ATP Assay Buffer
47μL
470μL
4.7mL
D-luciferin
1μL
10μL
100μL
Luciferase
1μL
10μL
100μL
3、操作步驟
⑴ 在白色96孔板中設(shè)置空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，參考下表，在空白對照孔中加入50 μL ATP Assay Buffer，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μL梯度濃度ATP 檢測工作液 (0.0039-1μM)，在樣品孔中加入50 μL樣品。
空白對照孔
標(biāo)準(zhǔn)品孔
樣品孔
ATP Assay Buffer
50μL
——
——
⑵ 如上表所示，各孔加入50μL的ATP檢測工作液，混勻，室溫孵育5分鐘。
⑶ 待反應(yīng)完成后，利用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測定相對發(fā)光強度（RLU）。
⑷ 計算結(jié)果：利用標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式，然后利用各樣品的RLU值計算樣品中ATP濃度。ATP標(biāo)曲測定如下圖所示：
細(xì)胞活性檢測是連接基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的橋梁。通過上述六種常用方法，研究人員可以更準(zhǔn)確地評估細(xì)胞的生存狀態(tài)，為疾病治療和藥物開發(fā)提供重要信息。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來可能會有更多創(chuàng)新的檢測方法問世，為我們揭示細(xì)胞活力的更多奧秘。
本期產(chǎn)品推薦：
MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒
500T
Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
100T
細(xì)胞染色產(chǎn)品推薦：
貨號
產(chǎn)品名稱
λEx/λEm (nm)
產(chǎn)品描述
DiO 高氯酸鹽（綠色）
484/501
活細(xì)胞示蹤、細(xì)胞膜染色
DiD 對氯苯磺酸鹽（紅色）
644/663
活細(xì)胞示蹤、細(xì)胞膜染色
霍亂毒素B亞單位（CTB）
—
神經(jīng)示蹤劑
霍亂毒素B亞單位-FITC
494/520
神經(jīng)示蹤劑
DiR 碘化物（深紅色）
748/780
動物活體成像
羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（橙紅）
540/565
細(xì)胞骨架染色（F-action）
鬼筆環(huán)肽-Fluor 488 (綠色)
493/517
細(xì)胞骨架染色（F-action）
鬼筆環(huán)肽-Fluor 555（橙紅）
556/574
細(xì)胞骨架染色（F-action）
鈣黃綠素紅（紅色）
560/574
細(xì)胞質(zhì)染色
CFSE(綠色)
492/517
細(xì)胞質(zhì)染色
PKH26紅色熒光細(xì)胞連接試劑盒
551/567
外泌體染色
PKH67綠色熒光細(xì)胞連接試劑盒
490/502
外泌體染色
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)綠色熒光探針
489/520
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針
587/615
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色
DAPI染色液 （藍(lán)色）
364/454
細(xì)胞核染色
Hoechst 33342（藍(lán)色）
350/461
細(xì)胞核染色
7-AAD（紅色）
545/650
細(xì)胞核染色
PI染色液（紅色）
535/617
細(xì)胞核染色
Fluo 3-AM
506/526
鈣離子（Ca2+）探針
DCFH-DA
502/523
活性氧（ROS）探針
DAF-2 DA
491/513
一氧化氮（NO）探針
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