Tubulin是構(gòu)成微管網(wǎng)絡(luò)的重要蛋白，可分為α、β、γ、δ、ε等多種類型，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體，是形成微管的最主要的兩種Tubulin。大家最熟悉的β-Tubulin常用在WB實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)參，然而微管蛋白在有絲分裂、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。今天小優(yōu)就和大家一起聊聊微管蛋白Tubulin的那些事兒。
 

01微管蛋白與腫瘤治療
由于惡性腫瘤細(xì)胞有著快速增殖能力，有絲分裂和微管功能都十分旺盛，使得微管成為有潛力的抗腫瘤靶點(diǎn)之一。但靶向微管藥物的長期應(yīng)用會導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而使其臨床療效逐漸減弱甚至失效。Katanin是一種微管剪切蛋白，可通過水解ATP剪切微管、使微管解聚。因此，同時(shí)作用于微管蛋白（Tubulin）和微管剪切蛋白（Katanin）的雙靶點(diǎn)化合物可能產(chǎn)生更強(qiáng)的微管動(dòng)力學(xué)擾亂和抗腫瘤作用，這種獨(dú)特的作用機(jī)制有望克服當(dāng)前微管靶向類藥物所面臨的耐藥性問題。
2024年7月12日，復(fù)旦大學(xué)王洋教授課題組在《Journal of Medicinal Chemistry》報(bào)道了一系列新型二芳基取代稠雜環(huán)類化合物，這類化合物具有強(qiáng)效抗腫瘤和抗多藥耐藥作用。它們靶向Katanin/Tubulin，其作用機(jī)制已被闡明，如化合物21b會破壞腫瘤細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
 

既然微管蛋白tubulin潛力如此巨大，我們又該如何去研究呢？有哪些研究工具呢？

02微管蛋白研究工具
高純度的Tubulin和Tubulin結(jié)合蛋白(MAPs)以及馬達(dá)蛋白(Motors)
腦組織的微管蛋白（純度大99%）（T240-A），可用于微管結(jié)合研究和微管聚合分析。來自癌癥細(xì)胞的微管蛋白，可適用于藥物篩選；熒光標(biāo)記的高純度tubulin蛋白，可用于監(jiān)測活細(xì)胞中的微管動(dòng)力學(xué)，此外，我們還提供來自植物或真菌來源的微管蛋白。

Tubulin (porcine brain, >99% pure) T240-A
抗微管蛋白配體的IC50和EC50測定
微管結(jié)合研究
微管蛋白單體結(jié)合研究
HDAC6研究
微管激活驅(qū)動(dòng)蛋白ATPase測定

Tubulin (HTS format, porcine, 8 assays) HTS03-A
微管蛋白配體藥物初步篩選中T240的經(jīng)濟(jì)替代品 
高通量微管蛋白聚合或解聚篩選
生產(chǎn)用于HTS運(yùn)動(dòng)分析的微管底物

Tubulin MAP-rich (porcine brain)  ML116-A
研究MAP對微管動(dòng)力學(xué)的影響
研究MAP和微管蛋白之間的結(jié)合位點(diǎn)
研究抗微管藥物對微管聚合的影響

Tubulin (HiLyte 488TM dye labeled; porcine, micro-injctn)  TL488M-B
Tubulin (Rhodamine labeled; porcine, micro-injctn)  TL590M-A
基于激光的應(yīng)用
監(jiān)測活細(xì)胞中的微管動(dòng)態(tài)
斑點(diǎn)顯微鏡
熒光微管的形成
MAP和微管相關(guān)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的顯微鏡研究
納米技術(shù)

微管結(jié)合蛋白  ( Microtubule Associated Proteins，MAP)  是與微管或微管蛋白可以相互作用的蛋白質(zhì)。通過與微管的相互作用，MAP蛋白執(zhí)行一系列功能，包括微管的動(dòng)態(tài)控制、沿微管運(yùn)輸、協(xié)助細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和塑性，以及一系列其他的功能。如常見的MAP1、MAP2和Tau蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中表達(dá)，且有助于穩(wěn)定微管的結(jié)構(gòu)。馬達(dá)蛋白（Motor）也可以被分類為MAP蛋白，通常也被稱為驅(qū)動(dòng)蛋白（Kinesin）或動(dòng)力蛋白（Dynein）。
CENP-E Motor domain (Hm.sap.) CP01-A
Eg5 Motor Domain (Hm.sap.)  EG01-A
KIFC3 Motor Domain (Hm.sap)  KC01-A
MKLP1 Motor Domain  MP01-XL
微管活化ATPase活性的測量
識別/表征影響運(yùn)動(dòng) ATPase活性的蛋白質(zhì)或小分子
影響驅(qū)動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)或小分子的鑒定/表征
識別/表征影響馬達(dá)/微管相互作用的蛋白質(zhì)或小分子

Tau (bovine brain)  TA01-B
微管結(jié)合蛋白研究的陽性對照
研究Tau對微管動(dòng)力學(xué)的影響

MAP Fraction MAPF-A
微管結(jié)合蛋白研究的陽性對照
研究MAP對微管動(dòng)力學(xué)的影響
許多蛋白激酶的底物

Tubulin染色探針
通過不同的探針和試劑和可以標(biāo)記微管蛋白，進(jìn)而研究微管動(dòng)力學(xué)。常用的Tubulin染色探針有SiR, SiR700和SPY™等，成像既明亮又穩(wěn)定。SiR-tubulin可穿透細(xì)胞，對微管具有高度特異性。Sir-tubulin 也可染色內(nèi)源性微管，無需進(jìn)行基因操作或過度表達(dá)，可用于活細(xì)胞和組織中的寬場、共聚焦、SIM或STED成像。
 

圖1：人類原代真皮成纖維細(xì)胞中用SiR-Tubulin標(biāo)記微管蛋白。

Tubulin聚合檢測試劑盒
微管的聚合、解聚狀態(tài)的失衡與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖息息相關(guān)。與微管蛋白相互作用的化合物或蛋白質(zhì)通常會改變聚合的一個(gè)或多個(gè)特征階段：成核期，生長期，和穩(wěn)態(tài)期，可以用微管蛋白聚合檢測試劑盒檢測上述特征階段。目前常見的微管蛋白聚合檢測試劑盒有兩種：
（1）基于吸光度（光散射）的經(jīng)典型分析方法（OD-based）：基于光散射原理，激發(fā)光透過微管會發(fā)生散射，其散射程度與微管聚合物的濃度在一定范圍內(nèi)成正比。

主要應(yīng)用：
篩查化合物對微管蛋白聚合活性的影響
篩查蛋白質(zhì)對微管蛋白聚合活性的影響
利用微管蛋白進(jìn)行HTS 

應(yīng)用示例：檢測微管蛋白配體對微管蛋白聚合的影響
 

圖2：單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)聚合反應(yīng)（G-PEM加5%甘油標(biāo)準(zhǔn)測定對照）以及在5µM paclitaxel、0.5μM paclitaxel和5µM nocodazole存在下的聚合反應(yīng)。在有5µM paclitaxel存在的情況下，Vmax值提高了4倍，而在有nocodazole存在的情況下，Vmax值降低了2.2倍。

（2）基于熒光分析（DAPI熒光基團(tuán)）的新型聚合分析方法（Fluorescence-based）：因?yàn)榫酆习l(fā)生時(shí)熒光報(bào)告基因會被摻入微管中，所以聚合后熒光增強(qiáng)。相較于吸光度測定的方法，熒光分析的檢測方法具有高靈敏度、高效、高通量且性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)。

主要應(yīng)用：
高通量抗癌化合物篩選
測量化合物IC50和微管蛋白特異性的基礎(chǔ)研究
篩選對微管蛋白聚合活性有影響的蛋白質(zhì)

應(yīng)用示例：檢測紫杉醇或長春新堿是否存在對微管蛋白聚合的影響
 

圖3：在標(biāo)準(zhǔn)聚合反應(yīng)中加入抗有絲分裂聚合增強(qiáng)劑紫杉醇（Paclitaxel）后，可以提高生長階段的Vmax值，而3μM微管抑制藥物長春堿（Vinblastine）引起V-max的急劇下降和最終聚合物質(zhì)量的降低。

表1：兩種微管蛋白聚合檢測方法的比較
 

微管/微管蛋白含量測定試劑盒
細(xì)胞或組織在一種能夠穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，這種裂解條件可以保持細(xì)胞內(nèi)微管與微管蛋白比例的真實(shí)情況。裂解后，通過離心將聚合的微管（沉淀部分）與非聚合的微管蛋白（上清部分）分離。之后，分別對上清液和沉淀物中的微管/微管蛋白進(jìn)行Western印跡分析。最終可以得到結(jié)合到細(xì)胞骨架上的微管蛋白量與存在于細(xì)胞質(zhì)中的游離微管蛋白量之間的比例。

主要應(yīng)用：
研究化合物對細(xì)胞中微管蛋白與微管比例的影響
研究突變細(xì)胞系與其親本細(xì)胞系相比，兩者微管蛋白與微管比例的變化
研究環(huán)境的物理變化對細(xì)胞中微管蛋白與微管比例的影響

應(yīng)用案例：經(jīng)紫杉醇處理與未經(jīng)紫杉醇處理的3T3細(xì)胞中的微管/微管蛋白分布對比
 

圖4：未經(jīng)紫杉醇處理和經(jīng)過紫杉醇處理的3T3細(xì)胞，其低速（LS）和超速離心（HS）樣本的Western印跡分析。將未經(jīng)處理或者用1μM紫杉醇處理過1小時(shí)的3T3細(xì)胞裂解物進(jìn)行低速（1000g）離心，低速離心得到的沉淀物（LSP）保存用于后續(xù)的Western分析。然后將低速離心的上清液再以100,000g進(jìn)行超速離心，并且保留上清液（HSS）和沉淀物（HSP），用于Western分析。結(jié)果表明：大部分經(jīng)紫杉醇穩(wěn)定的微管出現(xiàn)在低速顆粒（LSP/紫杉醇處理）中，而未處理樣品中的大部分微管出現(xiàn)在高速超顆粒中。這種微管、微管蛋白處在不同的上清或沉淀物中的結(jié)果，意味著紫杉醇能夠促進(jìn)微管的聚合，從而導(dǎo)致更多的微管蛋白在低速離心過程中沉淀下來，而非停留在上清中。

微管結(jié)合測定試劑盒
基于微管在高離心力（100,000 x g）作用下沉降的原理，因此，任何與微管相關(guān)的蛋白質(zhì)在離心時(shí)也會隨之沉降。通過簡單的SDS-PAGE分析上清液和沉降物，可以確定蛋白質(zhì)是否能與微管結(jié)合。

主要應(yīng)用：
確定蛋白質(zhì)或化合物是否與微管結(jié)合
測試各種缺失突變體結(jié)合微管的能力，然后計(jì)算它們對微管的親和力，從而確定微管結(jié)合位點(diǎn)
從細(xì)胞中提取驅(qū)動(dòng)蛋白的類似物或進(jìn)行突變后，測試它們對微管的親和力

應(yīng)用案例：檢測MAP蛋白是否與微管結(jié)合
 

圖5：使用BK029進(jìn)行MAP結(jié)合測定分析。將微管與緩沖液 (MT)、MAP蛋白(MT+MAPF)或BSA (MT+BSA) 混合，然后以100,000xg的速度離心使微管 沉淀。通過SDS-PAGE檢查上清液(S)和沉淀(P)級分。結(jié)果顯示：MAP蛋白與MT（MT+MAPF）結(jié)合并共沉淀。單獨(dú)的MAP(MAPF)或BSA (BSA) 蛋白不會沉淀。

Tubulin檢測抗體
可檢測α、β、γ等多種Tubulin亞型，包括人、大鼠、小鼠和酵母菌真菌等多種樣本。

注：WB：蛋白免疫印記；IF：免疫熒光；ICC：細(xì)胞免疫熒光；IHC：免疫組織化學(xué)；FCM：流式細(xì)胞術(shù)；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

Tubulin相關(guān)工具化合物
Tubulin相關(guān)的抑制劑、激動(dòng)劑等，用于體內(nèi)或體外研究。

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