1. 什么是 ChIP、CHIP研究什么？
CHIP全稱染色質(zhì)免疫沉淀法，是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它可以用來檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用，如組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等與基因組特定區(qū)域的結(jié)合情況。ChIP技術(shù)可以幫助研究者了解細(xì)胞或組織中的基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制。
 

圖一 組蛋白八聚體

名詞解釋
組蛋白：真核生物細(xì)胞核中的一種堿性蛋白質(zhì)，它們的主要功能是幫助DNA分子的壓縮和組織，使其能夠適應(yīng)細(xì)胞核內(nèi)有限的空間。組蛋白與DNA一起構(gòu)成了染色體的基本結(jié)構(gòu)單元，稱為核小體。
轉(zhuǎn)錄因子：是一類蛋白質(zhì)，它們可以結(jié)合到DNA分子上的特定序列，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中扮演著至關(guān)重要的角色，它們控制著基因表達(dá)的時(shí)間、地點(diǎn)和程度，從而影響細(xì)胞的功能和生物體的發(fā)育。
轉(zhuǎn)錄輔因子：是一類在增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間傳遞調(diào)控信息的蛋白質(zhì)，它們是轉(zhuǎn)錄激活和基因表達(dá)的核心效應(yīng)分子。轉(zhuǎn)錄輔因子通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，增強(qiáng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。它們可以對(duì)不同類型的核心啟動(dòng)子表現(xiàn)出特異性，這意味著不同的轉(zhuǎn)錄輔因子可能對(duì)不同的啟動(dòng)子類型有偏好性，從而影響基因表達(dá)的特異性和多樣性。

2. ChIP能做什么，使用場(chǎng)景有哪些？
確定特定蛋白質(zhì)在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)：通過使用針對(duì)特定蛋白質(zhì)的抗體，可以將這些蛋白質(zhì)及其結(jié)合的DNA片段從細(xì)胞中沉淀下來，然后通過測(cè)序或PCR分析這些DNA片段，從而確定蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點(diǎn)。
研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的動(dòng)態(tài)變化：可以在不同的時(shí)間點(diǎn)或不同的生理?xiàng)l件下進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，以研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的變化，例如在細(xì)胞分化、發(fā)育或響應(yīng)環(huán)境信號(hào)時(shí)。
分析組蛋白修飾：ChIP實(shí)驗(yàn)可以用來研究特定組蛋白修飾在基因組中的分布，這些修飾與基因的激活或沉默有關(guān)。
研究轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合特性：通過ChIP實(shí)驗(yàn)，可以確定轉(zhuǎn)錄因子在基因啟動(dòng)子區(qū)域或增強(qiáng)子區(qū)域的結(jié)合情況，從而揭示其調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。
全基因組分析：結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq），ChIP實(shí)驗(yàn)可以用于全基因組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)-DNA相互作用分析，提供高分辨率的基因組結(jié)合圖譜。

使用場(chǎng)景舉例： 
如果您對(duì)一種特定的轉(zhuǎn)錄因子如何在不同發(fā)育階段調(diào)控基因表達(dá)感興趣。你可以在胚胎發(fā)育的不同階段進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，使用針對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的抗體來沉淀與其結(jié)合的DNA片段。通過測(cè)序這些DNA片段，你可以確定該轉(zhuǎn)錄因子在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)，并分析這些位點(diǎn)在不同發(fā)育階段的變化。這些數(shù)據(jù)可以幫助你理解該轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而影響胚胎的發(fā)育過程。
另一個(gè)例子是研究組蛋白修飾。如果你想了解在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中，組蛋白H3的乙?；揎検侨绾巫兓?，你可以在應(yīng)激前后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，使用針對(duì)乙?；疕3的抗體。通過比較應(yīng)激前后的ChIP結(jié)果，你可以揭示應(yīng)激如何影響組蛋白修飾模式，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞功能

3. ChIP有哪些類型？
根據(jù)是否使用交聯(lián)劑，可以分為天然 ChIP (N-ChIP) 和交聯(lián) ChIP (X-ChIP)。
標(biāo)準(zhǔn)ChIP（X-ChIP）：在這種實(shí)驗(yàn)中，使用交聯(lián)劑（如甲醛）來固定細(xì)胞，這樣可以將蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用固定下來。交聯(lián)是必要的步驟，因?yàn)樗梢苑€(wěn)定蛋白質(zhì)與DNA之間的暫時(shí)性或弱相互作用，使得在后續(xù)的染色質(zhì)制備和免疫沉淀過程中這些相互作用不會(huì)解離。適用于研究那些與DNA結(jié)合不是非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)錄因子。
天然ChIP（N-ChIP）：在這種實(shí)驗(yàn)中，不使用交聯(lián)劑。這種方法通常用于研究那些與DNA結(jié)合非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，如某些組蛋白修飾，它們的結(jié)合足夠穩(wěn)定，以至于不需要額外的交聯(lián)就能在實(shí)驗(yàn)過程中保持與DNA的結(jié)合。

4.ChIP 實(shí)驗(yàn)中磁珠法和瓊脂糖珠法有什么不同？
操作便利性：使用磁珠可以快速分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，不需要離心，操作簡(jiǎn)便，樣品不容易丟失，洗得更徹底。傳統(tǒng)的方法是使用瓊脂糖珠，價(jià)格便宜，但需要離心，耗時(shí)長(zhǎng)，且在離心過程中珠子可能破裂。
特異性：磁珠法通常具有較高的特異性，因?yàn)榇胖楸砻婵梢愿鶆虻亟Y(jié)合抗體，減少了非特異性結(jié)合。瓊脂糖珠法需要額外的預(yù)清除步驟來減少這種非特異性結(jié)合。
成本：磁珠法雖然操作簡(jiǎn)便，但磁珠的成本通常高于瓊脂糖珠。瓊脂糖珠法成本較低，適合預(yù)算有限的實(shí)驗(yàn)室。
應(yīng)用范圍：磁珠法適用于高通量測(cè)序，如ChIP-Seq，因?yàn)榇胖椴粫?huì)在測(cè)序過程中產(chǎn)生干擾。
瓊脂糖珠法：適用于傳統(tǒng)的ChIP實(shí)驗(yàn)，但在高通量測(cè)序中可能會(huì)受到限制。

為什么瓊脂糖珠法會(huì)影響測(cè)序？
瓊脂糖珠與DNA的結(jié)合：在ChIP實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)是沉淀與特定蛋白質(zhì)（如組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合的DNA。瓊脂糖珠表面通常通過共價(jià)鍵結(jié)合有蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G，這些蛋白質(zhì)能夠與抗體的Fc段結(jié)合。當(dāng)抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合后，與之相連的DNA也應(yīng)該被捕獲。然而，瓊脂糖珠本身也可能非特異性地結(jié)合DNA，這種結(jié)合可能會(huì)在珠子表面形成一層DNA包裹，從而阻礙DNA的洗脫和后續(xù)的分析。
物理屏障：被瓊脂糖珠非特異性結(jié)合的DNA可能形成一種物理屏障，阻止洗脫緩沖液中的化學(xué)成分接觸到所有被捕獲的DNA，或者阻礙測(cè)序平臺(tái)的酶和試劑接觸到目標(biāo)DNA。這種物理屏障會(huì)影響DNA的洗脫效率和測(cè)序的覆蓋度。

洗脫效率：在ChIP實(shí)驗(yàn)的最后階段，需要將沉淀的DNA從瓊脂糖珠上洗脫下來以便進(jìn)行后續(xù)的分析，如PCR、qPCR或測(cè)序。如果DNA被封閉，洗脫效率會(huì)降低，導(dǎo)致洗脫下來的DNA量減少，這會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
測(cè)序覆蓋度：由于DNA封閉現(xiàn)象，一些DNA片段可能無法被有效地洗脫和擴(kuò)增，導(dǎo)致測(cè)序時(shí)這些區(qū)域的覆蓋度不足。這可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的分析產(chǎn)生偏差，因?yàn)槟承﹨^(qū)域可能被錯(cuò)誤地認(rèn)為是沒有相互作用發(fā)生的。
測(cè)序準(zhǔn)確性：DNA封閉還可能導(dǎo)致測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性下降。由于封閉的DNA片段可能無法被測(cè)序平臺(tái)準(zhǔn)確讀取，這可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)中的假陰性結(jié)果。

5.ChIP 是如何工作的？
 

圖二：chip實(shí)驗(yàn)流程

以交聯(lián)ChIP即X-ChIP為例,實(shí)驗(yàn)的工作原理可以概括為以下幾個(gè)步驟：
交聯(lián)：細(xì)胞或組織首先被甲醛或其他交聯(lián)劑處理，這一步使得蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用以及蛋白質(zhì)之間的相互作用被固定下來，防止在后續(xù)步驟中解離。
細(xì)胞裂解和染色質(zhì)剪切：交聯(lián)后的細(xì)胞被裂解，釋放出染色質(zhì)。
染色質(zhì)隨后被剪切成較小的片段，這可以通過超聲波處理（sonication）或酶消化（如使用微球菌核酸酶MNase）來實(shí)現(xiàn)。這一步是為了讓目標(biāo)DNA片段變短，便于后續(xù)的沉淀和分析。
免疫沉淀：使用針對(duì)特定蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行免疫沉淀。這些蛋白質(zhì)可以是直接與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，也可以是與DNA相互作用的組蛋白或其修飾形式。
抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合后，通過與蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G偶聯(lián)的珠子（beads）來沉淀這些復(fù)合物。
逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：沉淀下來的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物被加熱或其他方法處理以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)與DNA分離。
DNA純化和分析：釋放的DNA被純化，并通過PCR、qPCR、微陣列或測(cè)序（如ChIP-seq）等方法進(jìn)行分析，以確定特定蛋白質(zhì)在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白修飾的分布。
數(shù)據(jù)分析：對(duì)于ChIP-seq等高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，需要通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析，以識(shí)別富集的DNA區(qū)域，并通過比較不同樣本或條件下的數(shù)據(jù)來揭示蛋白質(zhì)-DNA相互作用的差異。 

6.ChIP如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞交聯(lián)
在ChIP實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞交聯(lián)通常是通過使用甲醛或多聚甲醛來實(shí)現(xiàn)的。交聯(lián)的目的是將蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用固定下來，以便在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟中進(jìn)行分析。
甲醛：能夠穿透細(xì)胞并與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基以及DNA的堿基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。甲醛交聯(lián)的特點(diǎn)是形成的共價(jià)鍵是可逆的，這意味著在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以通過特定的化學(xué)處理（如加入甘氨酸）來終止交聯(lián)，以便進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)的分離和分析。
多聚甲醛：多聚甲醛是甲醛的聚合形式，通常以粉末狀態(tài)存在，使用前需要在熱水中溶解以形成甲醛溶液。多聚甲醛在水溶液中會(huì)緩慢釋放甲醛，因此也可以用于細(xì)胞的交聯(lián)。
多聚甲醛的優(yōu)點(diǎn)是它比甲醛更穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存和處理，但釋放甲醛的速度較慢，在使用時(shí)需要確保完全水解成甲醛。

7.過度交聯(lián)的影響
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞：過度交聯(lián)可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響其與DNA的相互作用。
抗原表位掩蓋：交聯(lián)劑可能會(huì)與蛋白質(zhì)的抗原表位發(fā)生反應(yīng)，從而掩蓋這些表位，使得后續(xù)的抗體無法有效識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)。
DNA損傷：過度交聯(lián)可能導(dǎo)致DNA鏈之間過度交聯(lián)，使得DNA片段在超聲或酶消化過程中難以被有效切割，影響染色質(zhì)片段化的質(zhì)量。
分辨率降低：在ChIP實(shí)驗(yàn)中，理想的DNA片段大小通常在200-800 bp之間。過度交聯(lián)可能會(huì)使得超聲處理難以將染色質(zhì)切割到理想的片段大小，從而降低實(shí)驗(yàn)的分辨率。
實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差：由于過度交聯(lián)的條件難以精確控制，每次實(shí)驗(yàn)的交聯(lián)程度可能存在差異，這會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性變差。
樣品損失：在過度交聯(lián)的情況下，蛋白質(zhì)和DNA的復(fù)合物可能在后續(xù)的洗滌和純化步驟中損失，因?yàn)檫^度交聯(lián)可能增強(qiáng)這些復(fù)合物之間的結(jié)合力。
 

圖三 交聯(lián)時(shí)間的影響

小鼠心臟 (H)、腦 (B) 和肝臟 (L) 細(xì)胞需交聯(lián) 10 分鐘或 30 分鐘，如圖（左小圖）所示。染色質(zhì)制備后聲處理 4 分鐘，富集的 DNA 通過使用指定基因引物進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 來進(jìn)行定量（右小圖）。每份樣品中的免疫沉淀 DNA 量表示為標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)與陰性位點(diǎn) GAPDH 的比值（等于 1）。
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8.為什么要將染色質(zhì)片段化？
提高抗體接觸：染色質(zhì)是DNA和組蛋白緊密結(jié)合的復(fù)合物，通常存在于細(xì)胞核中。在ChIP實(shí)驗(yàn)中，需要使用特定抗體來識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)。將染色質(zhì)片段化可以增加抗體接觸和結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)。
便于免疫沉淀：染色質(zhì)片段化后，DNA片段的長(zhǎng)度通常在200-1000堿基對(duì)之間。這樣的片段大小便于抗體識(shí)別和結(jié)合，同時(shí)也便于后續(xù)的免疫沉淀步驟。
提高分辨率：通過將染色質(zhì)切割成較小的片段，ChIP實(shí)驗(yàn)可以提供更高的分辨率，從而更精確地定位蛋白質(zhì)在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。
減少背景信號(hào)：適當(dāng)?shù)娜旧|(zhì)片段化有助于減少非特異性的背景信號(hào)，因?yàn)檩^大的染色質(zhì)片段可能包含多個(gè)非目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致非特異性的免疫沉淀。
便于DNA純化和分析：較小的DNA片段更容易從蛋白質(zhì)中分離出來，便于后續(xù)的DNA純化和分析，如PCR、測(cè)序或微陣列分析。
提高實(shí)驗(yàn)效率：適當(dāng)?shù)娜旧|(zhì)片段化可以提高ChIP實(shí)驗(yàn)的效率，因?yàn)檩^小的片段更容易被處理和分析，從而減少了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和時(shí)間。

9.超聲法和酶解法的區(qū)別？
超聲法：能夠產(chǎn)生隨機(jī)大小的DNA片段，適用于需要評(píng)估組蛋白和組蛋白修飾的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@些是染色質(zhì)的富集和穩(wěn)定組分。超聲法適合于X-ChIP，即交聯(lián)后的染色質(zhì)。但是需要優(yōu)化超聲處理?xiàng)l件以避免過度破碎。超聲處理產(chǎn)生熱量，需要在冰冷的條件下進(jìn)行，并且要避免氣泡的產(chǎn)生（氣泡會(huì)導(dǎo)致局部溫度無法有效冷卻，影響效率和準(zhǔn)確性，同時(shí)會(huì)造成剪切力不均等）。在實(shí)驗(yàn)的一致性和重復(fù)性對(duì)比酶解法較差。
酶解法：使用微球菌核酸酶（MNase）等酶進(jìn)行染色質(zhì)的溫和碎裂，相對(duì)溫和更適合于評(píng)估轉(zhuǎn)錄因子和輔因子的結(jié)合，因?yàn)檫@些因子與DNA的相互作用可能不太穩(wěn)定。酶解法在實(shí)驗(yàn)之間具有更高的可重復(fù)性，并且產(chǎn)生的DNA片段大小相對(duì)一致，但酶消化可能不會(huì)產(chǎn)生染色質(zhì)的隨機(jī)切片，而是有偏好性地切割某些區(qū)域，可能導(dǎo)致某些位點(diǎn)被過度表達(dá)或遺漏。此外，酶解法操作仍需要超聲處理來打破核膜并在用酶消化后釋放出染色質(zhì)。
X-ChIP常用的染色質(zhì)片段化的方式為酶解法（微球菌核酸酶MNase）和超聲法，N-ChIP更依賴于酶解法。

10.如何確定染色質(zhì)片段化的程度？
瓊脂糖凝膠電泳是最常用的方法來檢查染色質(zhì)片段化的效果，徹底的 MNase 消化會(huì)產(chǎn)生含 150 個(gè)堿基對(duì)的 DNA 片段（單核小體），不徹底的消化也能產(chǎn)生含 150 - 750 個(gè)堿基對(duì)的 DNA 片段（單核小體、雙核小體和三核小體）。超聲處理產(chǎn)生 150 - 1000 個(gè)堿基對(duì)的許多染色質(zhì)片段。要確定獲得所需 DNA 大小并避免不必要的染色質(zhì)損傷所需要的最低聲處理量。
 

圖四 酶消化的染色質(zhì)在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行處理

泳道 1 顯示消化不足的染色質(zhì)。泳道 2 顯示消化適當(dāng)?shù)娜旧|(zhì)，而泳道 3 則顯示過度消化的染色質(zhì)。
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