大家好！今天我們來聊聊免疫組化（IHC）實驗的操作流程。IHC是一個超級強大的技術(shù)，能夠讓你在組織切片中找到特定的蛋白質(zhì)。跟我來，我們一步步搞定它，讓實驗變得輕松愉快！

IHC 實驗流程：通常包括樣本固定、包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復染、封片觀察 12 個部分

1.樣本固定

目的：確保組織樣本的質(zhì)量和完整性，為后續(xù)的免疫染色打下堅實基礎。

操作步驟：

1）取材：從動物或人體取得所需的組織樣本。對于組織塊，要確保其大小適中，不宜過大，以便于固定液能夠充分滲透。

2）初步處理：如果組織樣本帶有血液或其他體液，應先用生理鹽水或 PBS 進行沖洗，以去除這些可能影響固定效果的物質(zhì)。

3）固定：將組織樣本放入固定液中。常用的固定液有4%多聚甲醛溶液（abs9179），冰凍切片/神經(jīng)組織可以使用OCT包埋劑（abs9756）固定液的量通常為組織體積的 10-20 倍，以確保組織能夠充分浸入固定液中。大組織標本應切開固定，以免中間部分自溶解腐敗。

固定時間根據(jù)組織類型和實驗要求而定，一般固定時間室溫 18-24 h。

4）固定后的處理：固定完成后，將組織從固定液中取出，用流水沖洗數(shù)分鐘，以去除殘留的固定液和可能產(chǎn)生的結(jié)晶。 

注意事項：

固定的時間不宜過長，以免導致組織過度硬化和抗原性的喪失。

固定的溫度通常為室溫或 4°C，避免高溫導致組織損傷。

在固定過程中，要確保組織樣本完全浸入固定液中，避免出現(xiàn)未固定的部分。

固定的容器應干凈、無雜質(zhì)，避免對組織造成污染。

2. 包埋

目的：保護和支撐組織樣本，以便在切片時保持其完整性。通過將組織樣本嵌入到固體介質(zhì)中，可以制作出適合在顯微鏡下觀察的薄切片。

根據(jù)樣本類型可以分為石蠟切片免疫組化（IHC-P）和冰凍切片免疫組化（IHC-F），石蠟切片免疫組化雖然操作更加復雜，但其可以更好的保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，厚度更薄便于染色和觀察，以及可以常溫保存多年的優(yōu)點，在實驗中更為常用。

基本步驟：

1）脫水：在組織樣本固定后，需要將其中的水分去除，以便于包埋介質(zhì)能夠充分滲透。酒精梯度脫水: 75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）

2）透明：脫水后，組織樣本會變得不透明，需要使用透明劑（如二甲苯）來去除其中的酒精和其他溶劑，使組織樣本變得透明。通常用二甲苯浸泡：二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）

3）浸蠟：將透明后的組織樣本放入熔化的石蠟中，讓石蠟充分滲透到組織樣本中。這個過程通常需要在溫箱中進行，以確保石蠟的均勻滲透：63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）

4）包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具中，倒入熔化的石蠟，然后讓石蠟冷卻凝固。這樣，組織樣本就被包埋在石蠟中了。

注意事項：

在包埋過程中，要控制好溫度和時間，以確保石蠟的均勻滲透和組織的完整性。

包埋后的組織塊需要冷卻凝固后才能進行切片。在冷卻過程中，要避免過度冷卻導致石蠟碎裂或組織變形。

在包埋前，要對組織樣本進行充分的固定和脫水處理，以確保其抗原性和完整性。

3. 切片

目的：將包埋后的組織樣本切割成薄片，以便于在顯微鏡下觀察和檢測。

基本步驟：

1）切片前的準備：確保包埋后的組織塊已經(jīng)充分冷卻并固化。使用適當?shù)那衅瑱C進行切片。

2）切片：將包埋好的組織塊固定在切片機的樣本夾上。調(diào)整切片機的切片厚度，通常為 4-5 微米厚，這個厚度是根據(jù)需要檢測的抗原和實驗要求來確定的。

3）展片：使用刷子或毛筆輕輕地將切好的組織切片從刀上取下，并放在溫水 (40℃) 中展開。

4）烤片：60℃ 烤片 2 h。

注意事項：

在切片過程中，要控制好切片機的速度和切片刀的鋒利度，以獲得高質(zhì)量的切片。

切片后，要及時對切片進行處理，以避免抗原的損失和組織的變性。

使用適當?shù)酿べN劑，確保切片牢固地附貼在載玻片上，以便于后續(xù)的免疫組化實驗。

4. 脫蠟水化

目的：將組織切片從石蠟中釋放出來，并使其恢復到適合進行后續(xù)抗原檢測和染色的狀態(tài)。

基本步驟：

1）脫蠟：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蠟。將切片放置于切片架內(nèi)：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）

2）水化：100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)

注意事項：

徹底脫蠟：脫蠟過程必須徹底，以確保石蠟被完全去除。否則，殘留的石蠟會影響后續(xù)的抗原檢測和染色。

避免干燥：在整個脫蠟水化過程中，應確保切片始終保持在濕潤的狀態(tài)，避免干燥。干燥會導致非特異性抗體結(jié)合，從而出現(xiàn)高背景染色。

5. 抗原修復

目的：通過修復過程暴露被固定時隱藏的抗原表位，提高抗體的結(jié)合效率。最常用的修復緩沖液是 10 mM 的 pH 6.0 檸檬酸鈉（abs9248）、pH 9.0 的 Tris-EDTA （abs9342）、pH 8.0 的 EDTA。建議測試多種方法以尋找染色效果最佳的方法。

抗原修復的方法：

(1) 微波熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于微波爐中火 8 min，?；?7 min，轉(zhuǎn)小火 8 min；取出染色盒，冷卻至室溫。

(2) 水浴熱修復: 加入抗原修復液，放入切片，置于水溶鍋中加熱，其間不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效度 (92℃)，維持 40 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。

(3) 高壓熱修復: 在染色盒中加入抗原修復液，放入切片，置于高壓鍋內(nèi)加熱至飽壓后繼續(xù)加熱 5 min，關(guān)閉電源，10 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。

(4) 酶解修復：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當?shù)臏囟群蜐穸葪l件下進行酶解 (通常為 37°C，20 min)。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續(xù)處理。

注意事項：

加熱后需自然降溫

使用過量的抗原修復液

修復液的不同 pH 值對染色結(jié)果的影響比較大

沒有一種抗原修復緩沖液可以適用于所有抗原。不同的抗體可能需要不同的抗原修復方法和條件，因此需要根據(jù)實驗要求和抗體特性選擇合適的抗原修復方法。

6. 滅活

目的：消除細胞或組織中內(nèi)源性酶和活性物質(zhì)的影響，降低背景噪音，提高實驗的特異性和敏感性

1）滅活內(nèi)源性過氧化物酶：HRP檢測系統(tǒng)，常用的去除內(nèi)源性過氧化物酶的方法是 3%過氧化氫水溶液，室溫 10 min

2）洗滌：用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。

注意事項：

H₂O₂ 需現(xiàn)用現(xiàn)配，且 4℃ 避光保存，否則易引起非特異背景

H₂O₂ 孵育時間過長也會易引起脫片

部分組織還含有內(nèi)源性堿性磷酸酶，可用左旋咪唑進行滅活

7. 封閉

目的：封閉組織切片上非特異性結(jié)合位點，防止抗體與這些位點結(jié)合，從而減少背景信號。

基本步驟：

1）非特異位點封閉：將封閉液 (如 abs933山羊血清) 滴加到組織切片上，確保封閉液均勻覆蓋整個組織區(qū)域。然后將切片放入濕盒中，在室溫或 37°C 下孵育 30 min，讓封閉液與組織切片充分作用。

2）洗滌：封閉結(jié)束后，用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌切片，以去除未結(jié)合的封閉液和可能存在的雜質(zhì)。

8. 一抗孵育

免疫組化中的一抗孵育是免疫組化實驗的關(guān)鍵步驟之一

目的：特異性識別目標抗原，為后續(xù)的檢測提供準確標記。

基本步驟：

1）選擇一抗：根據(jù)實驗目的選擇特異性高、親和力強的一抗。一抗應該與目標抗原的種屬來源、類型等相匹配。

2）稀釋一抗：根據(jù)一抗的效價和實驗要求，用適當?shù)南♂屢喝?PBS、TBS等（或abs9299抗體稀釋液）稀釋一抗。

3）涂覆一抗：將稀釋好的一抗均勻涂覆在已封閉的組織切片上，確?？贵w能夠充分接觸組織切片上的抗原。

4）孵育：將稀釋好的一抗均勻滴加在已封閉的組織切片上，放入濕盒中，室溫 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗與抗原充分結(jié)合

注意事項：

確保一抗的質(zhì)量和特異性，避免使用過期或質(zhì)量不佳的一抗。

充分洗滌組織切片，去除未結(jié)合的一抗和其他雜質(zhì)，減少背景染色。

9.二抗孵育

目的：二抗的作用是與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-抗體復合物，從而增強信號的強度和特異性。

在免疫組化實驗中，二抗通常帶有標記酶 (如 HRP.AP 等)，這些標記物在后續(xù)的顯色步驟中可以產(chǎn)生可見的染色信號，便于在顯微鏡下觀察目標抗原在組織中的分布和表達情況。

二抗孵育的基本步驟：

1) 稀釋二抗：參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液或其他適當?shù)娜芤合♂尪埂?nbsp;

2) 孵育二抗：將稀釋好的二抗滴加在已經(jīng)過一抗孵育并洗滌的組織切片上，室溫孵育 30 min-60 min。

3) 洗滌：孵育完成后，使用洗滌液 (如 PBST 或 TBST) 在搖床上緩慢搖動洗滌切片，以去除未結(jié)合的二抗和其他雜質(zhì)。洗滌通常需要重復幾次，每次洗滌時間一般為 5-10 分鐘。

10. 顯色反應

目的：顯色檢測中需要考慮的其他因素有酶和顯色底物的選擇。每種檢測酶都有幾種不同的顯色劑

HRP-DAB 是最常用的顯色劑組合。

原理：在免疫組化中通常使用辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 等作為標記酶。這些酶能催化底物發(fā)生顏色反應，從而在抗原所在的位置形成可見的沉淀物。

基本步驟：

1）加入酶的底物 (如 HRP 的底物為 DAB，AP 的底物為 BCIP/NBT)。

2）底物在酶的作用下發(fā)生化學反應，形成有色沉淀物，通常呈現(xiàn)棕色 (對于HRP-DAB 系統(tǒng)) 或藍色 (對于 AP-BCIP/NBT 系統(tǒng))。

3）密切觀察切片顯色程度和顯色時間，一般為3-8min，及時用蒸餾水洗脫，防止顯色過深。通過顯微鏡觀察組織切片上的顏色變化，可以確定抗原在細胞或組織中的位置和表達水平。

注意事項：

DAB工作液現(xiàn)用現(xiàn)配

選擇適當?shù)臋z測系統(tǒng)：根據(jù)實驗目的和樣本特性選擇合適的檢測系統(tǒng)

優(yōu)化條件：對一抗、二抗的濃度、孵育時間和溫度等條件進行優(yōu)化，以獲得最佳的檢測結(jié)果

注意防護：DAB 為聯(lián)苯偶氨化合物，可誘發(fā)皮膚癌和膀胱癥，在顯色操作過程中需注意防護。

11. 復染

目的：為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可進行復染

復染：滴加 80-100 μL 蘇木素染色液至完全覆蓋組織，室溫孵育 5 min，1%鹽酸酒精分化1s，自來水稍洗，自來水返藍5min

注意事項：

復染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關(guān)

如果染色過淺可重復染色，如果染色過深可使用鹽酸進行分化。

12.封片觀察

目的：在免疫組化實驗中，封片觀察是最后的步驟，用于保護組織切片、增強對比度和穩(wěn)定性，并允許在顯微鏡下進行長期觀察和分析。

封片步驟：

1）脫水：在完成所有染色步驟后，通常需要將組織切片進行脫水處理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、無水乙醇 I、無水乙醇 Ⅱ 分別浸泡 1 min。

2）透明：脫水后，切片需要進行透明處理，以便封片劑能夠均勻分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡兩次，每次 1 min。

3）封片：將一滴封片劑 (如中性樹膠abs9177） 滴在組織切片上，然后用蓋玻片輕輕覆蓋。封片劑的選擇取決于實驗要求和標本類型。封片時要確保沒有氣泡產(chǎn)生，并且蓋玻片與切片之間緊密貼合。

4）干燥：讓封片劑自然干燥，或者可以在溫箱中加速干燥過程。干燥后的切片可以長期保存，并隨時用于觀察。

希望這份IHC實驗操作流程指南能幫助您在實驗中取得令人滿意的結(jié)果！如果有任何問題或需要進一步的幫助，請隨時聯(lián)系愛必信生物，我們隨時為您提供支持。

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