概述

類器官免疫共培養(yǎng)是一種先進(jìn)的研究手段，它結(jié)合了3D的類器官培養(yǎng)技術(shù)和免疫細(xì)胞，以模擬體內(nèi)微環(huán)境并研究細(xì)胞間的相互作用。這種共培養(yǎng)策略已被廣泛應(yīng)用于疾病建模、藥物篩選、個(gè)性化治療、炎癥機(jī)制研究、腫瘤免疫相互作用研究以及上皮-免疫細(xì)胞相互作用的研究。那么，如何評(píng)估類器官免疫共培養(yǎng)殺傷效果？小愛(ài)從免疫共培養(yǎng)方法和殺傷效果檢測(cè)方法兩方面給大家介紹一下。
 

免疫共培養(yǎng)方法

一、PBMC制備

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

試劑提前 1h 準(zhǔn)備：人淋巴細(xì)胞分離液(abs930)提前 1h取出，在室溫充分平衡并顛倒混勻

2、外周血梯度密度離心步驟

（1）采集人的外周血樣本于抗凝管中，室溫保存，血液樣品離體建議 2h內(nèi)處理效果最佳，若無(wú)法及時(shí)處理，4°C保存，12h 內(nèi)處理

（2）取 15mL離心管，加入 2mL血液，再加入 2-4 倍 PBS(abs962)稀釋外周血，吹打混勻

注意: 血液樣本越稀釋，單核細(xì)胞的純度越好

（3）取新的 15 mL離心管中，加入 5mL淋巴細(xì)胞分離液，將試管稍微傾斜將 4mL 稀釋的外周血懸液沿著管壁緩慢的加入離心管注意: 人淋巴細(xì)胞分離液在使用前需室溫充分平衡并顛倒混勻，分離時(shí)溫度以 18-25℃為宜，不要破壞淋巴細(xì)胞分離液和細(xì)胞懸液的分界面

（4）20℃，400g離心 30 分鐘

注意:離心結(jié)束速度要設(shè)置升速(ACC)1，降速(DEC)1，不能驟停

（5）離心后取出試管，可以看到不同的分層(如下圖1)，去除上層血漿層，小心地吸取白膜層(PBMC)到新的離心管中

（6）加入3 倍體積的 PBS，和白膜層充分混勻, 18-20°℃ 下以350g離心 10-15min。小心棄去上清液

（7）重復(fù)步驟6-次，進(jìn)行后續(xù)共培養(yǎng)。

圖1 離心后血液分層
 

二、類器官的收集

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中(24孔板，每5孔為一組)。

圖2 分離類器官
 

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14ml（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5分鐘（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。

3）接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g，4℃， 離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

圖3 分層現(xiàn)象
 

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

圖4 分層現(xiàn)象
 

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10分鐘）。

三、共培養(yǎng)

1、試劑準(zhǔn)備

T細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基：免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（abs9772）+200-500U/ml IL-2（abs04045）+ 3ug/ml CD3/CD28磁珠（abs160019）

類器官無(wú)血清培養(yǎng)基：提前放于4℃融化

96孔超低吸附培養(yǎng)板（abs7059）

注意: 使用無(wú)血清體系和超低吸附板均可有效避免類器官貼壁

2、共培養(yǎng)步驟

（1）使用T細(xì)胞無(wú)血清完全培養(yǎng)基重懸PBMC，96孔板，5*105 個(gè)PBMC/每孔，100uL細(xì)胞懸液/每孔。

（2）使用類器官無(wú)血清培養(yǎng)基重懸類器官，向含T細(xì)胞的96孔板中加入250-333個(gè)類器官/每孔，100ul類器官懸液/每孔，總體積200uL，進(jìn)行共培養(yǎng)。（24孔板，3-4萬(wàn)T細(xì)胞，類器官20個(gè)；96孔板，0.5-1萬(wàn)T細(xì)胞，類器官5-6個(gè)）

殺傷檢測(cè)方法

檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)腫瘤類器官殺傷效果有多種檢測(cè)指標(biāo)，比如，T細(xì)胞靶向識(shí)別殺傷、免疫浸潤(rùn)檢測(cè)、類器官毒性LDH檢測(cè)、上清細(xì)胞因子檢測(cè)、類器官活死染色。接下來(lái)，小愛(ài)給大家詳細(xì)聊一下每種檢測(cè)指標(biāo)。

一、T細(xì)胞靶向識(shí)別殺傷

使用CD31抗體偶聯(lián)FITC來(lái)標(biāo)記T細(xì)胞，可以幫助研究者追蹤和分析T細(xì)胞的行為，例如它們的遷移、分布和與類器官的相互作用。在上述免疫共培養(yǎng)方法的一、PBMC制備后，進(jìn)行T細(xì)胞標(biāo)記。

1、細(xì)胞計(jì)數(shù)和調(diào)整濃度：

計(jì)數(shù)T細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整細(xì)胞濃度，通常在實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞濃度調(diào)整到適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取?/p>

2、抗體與細(xì)胞的孵育：

將FITC標(biāo)記的CD31抗體（abs1840383）按照說(shuō)明書(shū)推薦的濃度與T細(xì)胞懸液混合，并在適當(dāng)條件下孵育一段時(shí)間，使抗體與T細(xì)胞表面的CD31抗原充分結(jié)合。

3、洗滌：

孵育后，使用適當(dāng)?shù)木彌_液（如PBS）洗滌T細(xì)胞，以去除未結(jié)合的抗體。

4、然后緊接著做免疫共培養(yǎng)方法的二、類器官的收集和三、共培養(yǎng)

5、使用高內(nèi)涵錄像及拍照，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)類器官的識(shí)別及趨向運(yùn)動(dòng)，如下圖片及視頻： 

圖5 殺傷效果明腸圖
 

此圖為我司做得免疫共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從上圖可明顯看出B藥物作用下，T細(xì)胞有明顯的殺傷效果。

視頻1 單獨(dú)類器官對(duì)照

視頻2 單獨(dú)T細(xì)胞對(duì)照

視頻3 T細(xì)胞和類器官共培養(yǎng)

圖解：相比于視頻1和視頻2，對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行CD31抗體偶聯(lián)FITC標(biāo)記后，會(huì)看到T細(xì)胞不斷趨向類器官，并在類器官周圍聚集，靶向識(shí)別殺傷類器官，最終類器官出現(xiàn)發(fā)黑、崩解、壞死。

二、免疫浸潤(rùn)檢測(cè)

1、將共培養(yǎng)后的類器官和懸浮的T細(xì)胞分離：小心用槍頭將上清吸棄，留下類器官；加入適量類器官傳代緩沖液（abs9730），吹打重懸類器官，待自然沉降后，吸棄掉上清，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇清洗次數(shù)。

2、類器官的石蠟切片免疫組化，可以參考鏈接類器官HE染色、免疫組化、免疫熒光鑒定方法，T細(xì)胞檢測(cè)marker根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求來(lái)，比如CD31。

三、類器官毒性LDH檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）Lactate Dehydrogenase Microplate Assay Kit（abs580007）

注意:

底物:使用前加入1ml蒸餾水溶解，-20℃保存。

染料試劑A:使用前加入9ml蒸餾水溶解，混合，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn):使用前加1ml蒸餾水溶解;然后加入0.3 ml到0.7 ml

蒸餾水，濃度為600 μmol/L。

陽(yáng)性對(duì)照:使用前加入0.1 ml蒸餾水溶解。

（2）酶標(biāo)板讀取器讀取吸光度在450 nm

（3）蒸餾水

（4）移液器，多通道移液器

（5）冰

（6）離心機(jī)

（7）計(jì)時(shí)器

2、樣本準(zhǔn)備

將共培養(yǎng)后的上清液轉(zhuǎn)移到試劑盒自帶的96孔微孔板。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

在微孔板中加入以下試劑:

注意:

（1）將上面的標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋2倍，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）對(duì)于未知的樣品，我們建議做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)和測(cè)試幾個(gè)劑量確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。如果酶活性較低，請(qǐng)?jiān)诜磻?yīng)體系中加入更多的樣品，或者增加反應(yīng)時(shí)間；如果酶活性較高，請(qǐng)稀釋樣品，或減少反應(yīng)時(shí)間。

4、計(jì)算

單位定義:一個(gè)單位的LDH活性被定義為酶每分鐘產(chǎn)生1nmol NADH。

1. 根據(jù)上清體積

LDH (U/ml) = (C_Standard × V_Standard) × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)/V_Sample/T 

= 1200 × (OD_Sample - OD_Control) / (OD_Standard - OD_Blank)

C_Standard：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，600 μmol/L = 600 nmol/ml; 

V_Sample：樣品體積，0.01 ml; 

V_Standard: 標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.1 ml; 

T: 反應(yīng)時(shí)間，5 minutes

5、典型數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供演示。每次測(cè)定必須重新測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

檢測(cè)范圍：30 μmol/L ~ 600 μmol/L
 

圖7 96孔板陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)柱狀圖

四、上清細(xì)胞因子檢測(cè)

類器官免疫共培養(yǎng)用于評(píng)估細(xì)胞殺傷效果時(shí)，可以通過(guò)檢測(cè)上清液中的細(xì)胞因子來(lái)反映免疫細(xì)胞的活性和對(duì)類器官的影響。以下是一些常見(jiàn)的細(xì)胞因子，它們?cè)谠u(píng)估免疫細(xì)胞殺傷效果時(shí)可能被檢測(cè)：

干擾素-γ (IFN-γ)：通常由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，與細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

腫瘤壞死因子-α (TNF-α)：由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)。

白細(xì)胞介素-2 (IL-2)：主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)T細(xì)胞增殖和活化。

白細(xì)胞介素-4 (IL-4)：主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，參與體液免疫反應(yīng)和抗炎作用。

白細(xì)胞介素-6 (IL-6)：一種多功能細(xì)胞因子，參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。

白細(xì)胞介素-10 (IL-10)：具有抗炎作用，由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

白細(xì)胞介素-12 (IL-12)：促進(jìn)Th1細(xì)胞分化和IFN-γ的產(chǎn)生。

白細(xì)胞介素-17 (IL-17)：主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，與炎癥和自身免疫疾病有關(guān)。

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)：促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖和活化。

粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF)：促進(jìn)中性粒細(xì)胞的增殖和活化。

趨化因子：如CXCL8（IL-8）、CCL2（MCP-1）等，參與免疫細(xì)胞的遷移和定位。

穿孔素 (Perforin)：由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞釋放，用于殺死靶細(xì)胞。

顆粒酶 (Granzymes)：與穿孔素一起由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞釋放，引起細(xì)胞凋亡。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子：如TGF-β，由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫抑制作用。

生長(zhǎng)因子：如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)，可能與腫瘤血管生成和免疫逃逸有關(guān)。

檢測(cè)這些細(xì)胞因子可以通過(guò)多種方法進(jìn)行，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、多因子檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞因子芯片、流式細(xì)胞術(shù)等。選擇哪種檢測(cè)方法取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、所需靈敏度和特異性、以及實(shí)驗(yàn)預(yù)算。通過(guò)分析這些細(xì)胞因子的水平，可以評(píng)估免疫細(xì)胞對(duì)類器官的殺傷效果和免疫反應(yīng)的總體情況。

以最常測(cè)的IFN-γ為例，采用ELISA方法舉例：

1、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（1）Human IFN-γ ELISA Kit（abs510007-96T）

（2）酶標(biāo)儀（可測(cè)量450nm檢測(cè)波長(zhǎng)的吸收值及540nm或570nm校正波長(zhǎng)的吸收值） 

（3）高精度加液器及一次性吸頭

（4）蒸餾水或去離子水 

（5）洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī) 

（6）500mL量筒

2、樣品準(zhǔn)備

培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過(guò)離心去除；立刻檢測(cè)樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍 存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。

3、試劑配制（使用前請(qǐng)將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測(cè)）

①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。 取10mL濃縮洗 例：滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。 

②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實(shí)際操作時(shí)可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計(jì)算所需的稀釋用緩沖液用 量，再進(jìn)行配制。 

③檢測(cè)抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前 需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計(jì)算所需體積。 使用了10個(gè)孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測(cè)抗 例：體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。 

④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例： 使用了10個(gè)孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。 

⑤顯色劑：按每孔100uL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使 用。 

⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為600pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震 搖至少5分鐘，其充分溶解。每個(gè)稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒(méi)有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（600pg/mL），稀釋用緩沖液 （1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0pg/mL）。

圖8標(biāo)準(zhǔn)品稀釋比例示意圖

二、操作步驟 

1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品； 

2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口； 

3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請(qǐng)立即使用不要讓微孔板干 燥； 

4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2 小時(shí); 

5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。 重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會(huì)有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請(qǐng)將板內(nèi)所有液體吸 干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體； 

6. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL檢測(cè)抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí)； 

7. 重復(fù)第5步洗板操作； 

8. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光； 

9. 重復(fù)第5步洗板操作； 

10. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光； 

11. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一 致，請(qǐng)輕拍微孔板，使溶液混合均勻； 

12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。如果沒(méi)有使用 雙波長(zhǎng)校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響； 

13. 計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃 度做對(duì)數(shù)與相應(yīng)OD值對(duì)數(shù)生成曲線，并通過(guò)回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過(guò)程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的 數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過(guò)稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

圖9標(biāo)準(zhǔn)曲線

注： 提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗(yàn)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

五、類器官活死染色

類器官活死染色是一種用于評(píng)估類器官中活細(xì)胞與死細(xì)胞比例的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)于研究類器官的增殖狀態(tài)和細(xì)胞凋亡具有重要意義。Calcein-AM是一種常用的活細(xì)胞熒光標(biāo)記染料，能夠發(fā)出綠色熒光，而碘化丙啶(PI)則用于標(biāo)記死細(xì)胞，發(fā)出紅色熒光。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，可以清晰地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

1、將共培養(yǎng)后的類器官和懸浮的T細(xì)胞分離：小心用槍頭將上清吸棄，留下類器官；加入適量類器官傳代緩沖液（abs9730），吹打重懸類器官，待自然沉降后，吸棄掉上清，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇清洗次數(shù)。

2、可以參考鏈接類器官原位活死染色實(shí)驗(yàn)攻略進(jìn)行活死染色。

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