Naveni® PLA技術(shù)歷史回顧

Navinci 是一家瑞典生物技術(shù)公司，是鄰近連接技術(shù) （Proximity Ligation Assay，PLA)的先驅(qū)，專門開發(fā)用于研究蛋白質(zhì)相互作用的創(chuàng)新解決方案。
2020年Navinci公司將Proximity Ligation Assay（PLA）技術(shù)進(jìn)行了更新，命名為：Naveni® Proximity Ligation Technology，此技術(shù)基于一項(xiàng)新的UnFold 專有技術(shù)，與傳統(tǒng)PLA技術(shù)相比，實(shí)驗(yàn)過程更加有特異型并且靈敏，主要更注重抗體的選擇。 
蛋白質(zhì)研究過程中的挑戰(zhàn)：
蛋白質(zhì)在細(xì)胞中主要通過修飾、形成動(dòng)態(tài)復(fù)合物等方式來執(zhí)行其功能，但這些過程無法通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或常規(guī)免疫染色方法來研究；組織是復(fù)雜的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，熒光標(biāo)記的檢測試劑在組織中會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合。
解決方案
Naveni® PLA技術(shù)，可對蛋白質(zhì)及其相互作用進(jìn)行準(zhǔn)確原位研究，檢測內(nèi)容包括：
-蛋白-蛋白互作
-同時(shí)檢測游離蛋白和相互作用蛋白（PPI）
-蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）
-在保留細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的情況下精確定位蛋白質(zhì)
-可生成且觀察到被背景遮擋的信號(hào)，提高檢測靈敏度
技術(shù)優(yōu)勢
可視化蛋白互作檢測技術(shù)（提供干凈、高分辨率的圖像，且可進(jìn)行量化）
目標(biāo)蛋白的存在信號(hào)放大（信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)）
可檢測含量極低的蛋白質(zhì)互作（微弱互作）
靈敏度高、特異性強(qiáng)
不受顯微鏡分辨率的影響
Naveni®  PLA工作原理 

1）封閉樣本
2）一抗孵育：兩種一抗分別與位于一種蛋白質(zhì)或兩種鄰近蛋白質(zhì)上的目標(biāo)表位結(jié)合
3）Navenibody孵育：Navenibodies（與專有寡核苷酸臂結(jié)合的精選抗體）與各自的一抗結(jié)合
4）DNA circle形成：當(dāng) Navenibodies 靠近時(shí)，附著的寡聚物能形成 DNA circle，通過減少非特異性背景染色來保證高特異性
5）擴(kuò)增和檢測：加入聚合酶后，就會(huì)啟動(dòng)滾環(huán)循環(huán)擴(kuò)增過程。標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的DNA結(jié)合，顯色形成亮點(diǎn)

已有報(bào)道證實(shí) Naveni® PLA實(shí)力
在“Improved efciency of in situ protein analysis by proximity ligation using UnFold probes”中，作者將更新后的Naveni® PLA技術(shù)與常規(guī)的PLA技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比，結(jié)果更加靈敏，有更強(qiáng)的信號(hào)生成。Naveni® PLA技術(shù)主要是在于二抗里面探針的更新，命名為：UnFold 探針。

兩者實(shí)驗(yàn)原理有哪些不同？ 

圖 1. 使用傳統(tǒng)探針和 UnFold 探針進(jìn)行PLA的示意圖。(a) 傳統(tǒng)PLA。(b) 使用 UnFold 探針的PLA反應(yīng)。(i) 在一對一抗體結(jié)合了一對相互作用的蛋白質(zhì)（紅色和綠色）并經(jīng)過洗滌后，加入二抗常規(guī)或 UnFold 原位PLA探針，孵育后再次進(jìn)行洗滌。(ii) 在(a)中的傳統(tǒng)設(shè)計(jì)中，再加入兩個(gè)可形成 DNA 圈的寡核苷酸。使用 (b) 中的 UnFold 設(shè)計(jì)，攜帶發(fā)夾環(huán)寡核苷酸的探針在 U 殘基處被裂解，釋放出可與同一條 DNA 鏈的 3′端連接的自由 5′端。與此同時(shí)，另一條 UnFold 探針的發(fā)夾 DNA 鏈上的 U 殘基也被裂解，從而產(chǎn)生一個(gè)單鏈模板，供酶連接第一條 UnFold 探針上的鏈的末端。(iii) 加入 DNA 連接酶，在兩種原位聚乳酸變體中形成 DNA 圈。(iv) 最后，加入 phi29 DNA 聚合酶，以其中一種抗體上的寡核苷酸為引物啟動(dòng) RCA，并用熒光寡核苷酸來觀察 RCA 產(chǎn)物。
*滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增（RCA）是一種基于環(huán)狀DNA模板的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。

結(jié)果如何？
用福爾馬林復(fù)染的parafn-embedded（FFPE）材料，作者分析了皮膚組織切片中 E-cadherin與β-catenin之間的相互作用。最后結(jié)果顯示在表皮中產(chǎn)生了特異性的聚類信號(hào)（圖 5）。與傳統(tǒng)的原位PLA相比，UnFold探針在表皮中的信號(hào)數(shù)量更多。

圖 5. 皮膚組織中 β-catenin 和 E-cadherin 相互作用的可視化。

接下來，作者比較了使用傳統(tǒng)PLA探針或 UnFold 探針檢測磷酸化蛋白的效率。用血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB)饑餓或刺激永久化的成纖維細(xì)胞 BJ hTert。使用抗-PDGFR 和抗-pan 磷酸化（pY100）作為一抗，兩種設(shè)計(jì)的二抗-寡核苷酸共軛物都能檢測到受刺激細(xì)胞中 PDGFR-β 磷酸化的增加（圖 6a）。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的原位聚乳酸相比，UnFold 設(shè)計(jì)在信號(hào)方面有明顯的不同。

圖 6. BJ hTert 細(xì)胞中 PDGFR-β 磷酸化的可視化。

(a）通過檢測 PDGFR-β 的磷酸化水平（抗 PDGFR 和抗 pan 磷酸化 (pY100) 抗體），比較血清饑餓的 BJ hTert 細(xì)胞（-）和經(jīng) PDGF-BB 處理 45 分鐘的冰凍細(xì)胞（+）。Te RCA 產(chǎn)物用 Cy3 標(biāo)記（合并圖像中的紅點(diǎn)），細(xì)胞核用 Hoechst 33342 染色。比例尺（白色）=50 µm。(b) 比較不同探針濃度下傳統(tǒng) PLA 和 UnFold 原位 PLA 的信號(hào)定量。 

Naveni®  PLA技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

圖注：長時(shí)間去極化會(huì)導(dǎo)致 GluA1-Shank3 相互作用減弱。（Ross & Eizenman, Neurosci. Lett. 2023）

Shank3 基因缺失與 ASD 有關(guān)
Shank3 通過與谷氨酸受體相互作用來調(diào)節(jié)突觸結(jié)構(gòu)
通過共質(zhì)譜（co-IP）和聚合酶鏈反應(yīng)（PLA）（NaveniFlex），證明 GluA1 與 Shank3 直接相互作用。
長時(shí)間的細(xì)胞外 KCl 升高會(huì)降低 GluA1 -Shank3 的相互作用。

Naveni®  PLA技術(shù)在前列腺癌機(jī)制研究中的應(yīng)用

背景介紹：是關(guān)于雄激素受體（AR）突變與前列腺癌和雄激素不敏感綜合征的關(guān)聯(lián)，這些突變可能會(huì)深刻影響AR的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和與染色質(zhì)的結(jié)合，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄特征和藥物反應(yīng)的改變。然而，目前的結(jié)構(gòu)信息無法解釋病理突變對AR結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的影響。

研究思路:是通過結(jié)合X射線晶體學(xué)、體外、體內(nèi)和計(jì)算模擬等方法，深入研究跨越AR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（AR-LBD）完整二聚體界面的選定突變對AR依賴的轉(zhuǎn)錄和抗雄激素反應(yīng)的影響。

研究結(jié)果：這些變體通過誘導(dǎo)AR-LBD中一個(gè)先前未描述的構(gòu)象開關(guān)，增加了一個(gè)重要甲基化靶點(diǎn)Arg761的暴露，從而改變了AR的轉(zhuǎn)錄和抗雄激素反應(yīng)。研究還證實(shí)了殘基Arg761和Tyr764對AR二聚化和功能的重要性。這些結(jié)果揭示了AR二聚化和翻譯后修飾的構(gòu)象耦合作為一種疾病機(jī)制，并對精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)具有重要意義。 

文中的PLA實(shí)驗(yàn)：
試劑：NaveniFlex Cell MR Atto647N（一抗：鼠，兔）
蛋白互作檢測： FL AR（全長雄激素受體） 和 內(nèi)源性 PRMT5 （蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5）
步驟：根據(jù)PLA實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，當(dāng)相近的 Navenibodies （二抗）相互作用時(shí)，分別與相近的熒光探針（ATTO647）進(jìn)行 DNA 雜交和擴(kuò)增，在經(jīng)過洗滌、培養(yǎng)、封片后，將載玻片在 4°C 黑暗中短期保存，或在蔡司熒光顯微鏡下觀察，并使用 ImageJ 軟件對至少 300 個(gè)細(xì)胞的相互作用進(jìn)行計(jì)數(shù)。

來自Andrea Alegre-Martí et al. ,A hotspot for posttranslational modifications on the androgen receptor dimer interface drives pathology and anti-androgen resistance.Sci. Adv.9,eade2175(2023).DOI:10.1126/sciadv.ade2175

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在 PC3- WT 和 PC3-Q799E 細(xì)胞中，AR-PRMT5 之間的相互作用很強(qiáng)，而在 PRMT5 受抑制的細(xì)胞中，這種作用明顯減弱（圖 A 和 B）；還顯示了 FL AR 的精氨酸單甲基化以及較弱的對稱二甲基化，在與 PRMT5 特異性抑制劑 GSK595 培養(yǎng)后，這種二甲基化減少了 50%（圖 D 至 F）；
在所有 PLA 實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到了不同的模式，一些細(xì)胞核顯示出強(qiáng)烈的 AR-PRMT5 或甲基化信號(hào)，而另一些則幾乎沒有這些信號(hào)（圖 A 和 C）。我們還注意到，在這些實(shí)驗(yàn)中，Q799E 突變體的水平明顯較低。

Naveni®  PLA技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的應(yīng)用
背景介紹：是關(guān)于EGFR 和 PDGFR在 細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞和信號(hào)傳導(dǎo)過程中，與膽固醇的關(guān)系。探究膜鞘對表皮生長因子受體（EGFR）信號(hào)傳導(dǎo)的作用，并比較其與血小板源性生長因子受體（PDGFR）的差異。

研究問題：是EGFR和PDGFR在內(nèi)化和信號(hào)傳導(dǎo)過程中是否存在差異，并且這些差異是否與膽固醇的耗竭有關(guān)。

解決思路：研究使用了BJ-hTERT細(xì)胞系，并通過使用甲基-β-環(huán)糊精（MbCD）來降低細(xì)胞中的膽固醇水平。通過Western blot分析EGFR的激活和下游信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)膽固醇的耗竭導(dǎo)致EGFR的磷酸化水平顯著增加，并且EGFR的二聚化也增加。然而，在PDGFR的研究中并沒有觀察到類似的效應(yīng)。此外，膽固醇的耗竭還導(dǎo)致AKT和ERK1/2的磷酸化水平顯著降低，但對EGFR和PDGFR的影響不同。 為了進(jìn)一步研究EGFR和PDGFR的內(nèi)化和傳導(dǎo)差異，研究使用免疫熒光顯微鏡觀察了兩種受體的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示，在EGF和PDGF-BB的共同刺激下，EGFR和PDGFR-b的共定位程度較低。這表明在配體刺激后，兩種受體在內(nèi)化和傳導(dǎo)過程中存在差異，并且這些差異與細(xì)胞膜中的膽固醇含量有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入理解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，并為進(jìn)一步研究相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

文中的PLA實(shí)驗(yàn)：
試劑：NaveniFlex Cell MR Red（一抗：鼠，兔）
蛋白互作檢測：EGFR 和 PDGFR -b
步驟：將 BJ-hTERT 細(xì)胞接種到 8 孔室載玻片中，在饑餓培養(yǎng)基中饑餓過夜，然后分別用 20 ng/ml EGF 或 20 ng/ml PDGF-BB 刺激 0、5、15 或 45 分鐘。然后按照免疫熒光顯微鏡部分的描述固定細(xì)胞并使其通透。然后按照Navinci說明書進(jìn)行PLA實(shí)驗(yàn)。使用蔡司成像儀 M2 顯微鏡和 Zen 2（藍(lán)色版），使用 40X/1.4 或 63X/1.4 油性物鏡和 Hamamatsu C11440 相機(jī)。樣品激發(fā)使用 HXP 120 V 光源（90% 強(qiáng)度）。 

    
圖 3 所示。EGFR 和 PDGFR 都通過網(wǎng)格蛋白包被的凹坑內(nèi)化，但在不依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑中偏離。為了研究 EGFR 和 PDGFR-b 內(nèi)化途徑的潛在差異，在 20 ng/ml EGF 或 PDGF-BB刺激后，使用近距離結(jié)扎法(PLA)研究了它們與網(wǎng)格蛋白或小囊蛋白-1 的共定位。Clathrin 與 EGFR 或 PDGFR-b 的共定位如圖(A 或 C)所示，并分別在(B 或 D)中進(jìn)行量化。Caveolin-1 與 EGFR 或 PDGFR-b 的共定位分別顯示在(E 或 G)和(F 或 H)中。細(xì)胞核為藍(lán)色，PLA 滾圈擴(kuò)增產(chǎn)物(RCP)為綠色。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。（來自Activated EGFR and PDGFR internalize in separate vesicles and downstream AKT and ERK1/2 signaling are differentially impacted by cholesterol depletion）

 Naveni®  PLA技術(shù)在卵巢癌預(yù)后中的檢測應(yīng)用

（Heinzl, Nicole et al. “Amyloid-like p53 as prognostic biomarker in serous ovarian cancer-a study of the OVCAD consortium.” Oncogene vol. 42,33 (2023): 2473-2484. doi:10.1038/s41388-023-02758-8）在漿液性卵巢癌中，p53 聚集是獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志，基于p53聚集體數(shù)量的來驗(yàn)證P53靶向療法可改善患者預(yù)后?；赑LA的原理，只有當(dāng)p53和淀粉樣抗體近距離結(jié)合時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，PLA結(jié)果表明p53確實(shí)以低聚聚集體的形式存在，信號(hào)數(shù)與ELISA結(jié)果一致。且可以應(yīng)用在FFPE樣本上，PLA是一種有前途的潛在診斷手段。

圖注：Proximity ligation assay (PLA) to demonstrate the presence of oligomeric p53 (white dots indicate the close proximity of the A11 and p53 antibody = presence of p53 aggregates, green = pan-cytokeratin, blue = nuclei, ×60 magnification, scale bar = 20 µm).

 Naveni®  PLA技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化中的檢測應(yīng)用

背景信息：在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中，平滑肌細(xì)胞（SMCs）從收縮/分化表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣?去分化表型。作者從豬冠狀動(dòng)脈中分離出分化的梭形(S)和去分化的菱形(R) SMCs。R-SMCs表達(dá)鈣結(jié)合蛋白S100A4。研究了apelin在這種表型轉(zhuǎn)化中的作用，以及它與S100A4的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)，與S-SMCs相比，apelin在R-SMCs中表達(dá)apelin高表達(dá)。已知可誘導(dǎo)向r-表型的轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生了apelin和S100A4的直接相互作用和核表達(dá)。

文中PLA實(shí)驗(yàn)：
試劑：NaveniFlex Cell MR （一抗：鼠，兔）
蛋白互作檢測： S100A4 與 apelin 蛋白
顯微鏡：
使用 Axioskop 2 顯微鏡（卡爾蔡司，耶拿，德國）拍攝圖像，該顯微鏡配備了平面 neofuar×20/0.50 物鏡和高靈敏度、高分辨率彩色數(shù)碼相機(jī)（Axiocam，卡爾蔡司），使用 Zen 2.3 軟件（卡爾蔡司），并使用 Adobe Photoshop 進(jìn)行處理。使用 QuPath 圖像分析軟件 0.4.3 版對 PLA 復(fù)合物/細(xì)胞進(jìn)行定量。

結(jié)果顯示：在PDGF-BB刺激下，S-SMCs（平滑肌細(xì)胞）的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都可以檢測到PLA apelin/S100A4復(fù)合物。這表明apelin通過影響S100A4的表達(dá)和定位，在SMCs的表型轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用。（來自Apelin is expressed in intimal smooth muscle cells and promotes their phenotypic transition）

 Naveni®  PLA技術(shù)在抗腫瘤治療中的應(yīng)用

背景信息：eIF4F是一個(gè)由eIF4E、eIF4G和PABP三個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，eIF4F的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后有關(guān)。本研究檢測病人樣本中，在anti-BRAF和anti-MEK治療中，檢測eIF4F復(fù)合物的改變。

圖注：在 vemurafenib 處理過或未處理過的細(xì)胞系中，通過近接試驗(yàn) (PLA) 檢測到 eIF4E-eIF4G 或 eIF4E-4EBP1 的相互作用。相互作用表現(xiàn)為紅色斑點(diǎn)。（來自eIF4F is a nexus of resistance to anti-BRAF and anti-MEK cancer therapies） 

PLA 顯示：在anti-BRAF治療中，eIF4F復(fù)合物形成比率在免疫應(yīng)答的腫瘤中降低，在抗藥性轉(zhuǎn)移腫瘤中升高;
意義:
eIF4F 不僅能夠作為先天( innate ) 和獲得性( acquired ) 抗性的指示器，也能作為抗腫瘤治療的靶標(biāo);
靶向 BRAF (and/or MEK) 和 eIF4F的聯(lián)合治療能夠克服大多數(shù)在BRAF(V600)-突變型腫瘤中不斷增加的藥物抗性

圖注：病人組織樣本中eIF4F復(fù)合物的形成

a. PLA檢測不同時(shí)間病人組織樣本中eIF4E-eIF4G和eIF4E-4EBP1的相互作用
b.PLA 定量顯示復(fù)合物形成比

圖注：PLA技術(shù)檢測7個(gè)病人腫瘤組織中eIF4F 復(fù)合物形成，vemurafenib或dabrafenib治療前后，eIF4E與eIF4G 和eIF4E與4EBP1的相互作用，每個(gè)棕色的點(diǎn)狀信號(hào)代表一個(gè)復(fù)合體。PLA技術(shù)在病理組織蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精確性;優(yōu)于傳統(tǒng)IHC實(shí)驗(yàn)，能夠高質(zhì)量建立病樣組織標(biāo)本庫。
 

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