背景介紹
過量飲酒會導致肝臟氧化應激、脂肪堆積和炎癥。隨著酒精性肝病（ALD）在全球的流行，ALD的研究迅速增加。目前，許多研究試圖發(fā)現(xiàn)有效治療ALD的藥物，包括使用抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和調(diào)節(jié)腸道微生物群的藥物。
甘油三脂檢測在ALD研究中的應用
肝脂積聚是酒精性肝病的主要病理特征之一。先前的研究表明，二甲雙胍通過抑制硬脂酰輔酶A脫飽和酶1(SCD1)或miR-33b的表達來抑制高糖和高胰島素誘導的肝細胞TG蓄積。還有研究表明，二甲雙胍可以通過激活AMPK信號通路逆轉脂肪肝。然而，其在ALD中的作用尚不清楚。
Xie等[1]采用一系列檢測手段探究了二甲雙胍調(diào)節(jié)酒精性肝病脂代謝的可能機制。其中甘油三酯（TG）檢測試劑盒（abs580085）用于檢測細胞內(nèi)TG的濃度，以確定二甲雙胍對ALD的影響。
甘油三酯檢測試劑盒使用方法介紹
檢測原理：
甘油三酯（TG），也稱為三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和動物脂肪中的主要成分。在人體內(nèi)，血液中甘油三酯的高水平與動脈粥樣硬化、心臟病和胰腺炎有關。試劑盒檢測原理是利用脂肪酶對甘油三酯進行水解，產(chǎn)生甘油和游離脂肪酸。隨后通過偶聯(lián)酶促反應在500 nm下比色讀數(shù)，測定釋放甘油的量，再換算成甘油三酯的含量。
96-Well Microplate
1 plate
—
Dye Reagent
Powder × 1
-20 ℃
Standard (5 mmol/L)
1 mL × 1
4 ℃
Plate Adhesive Strips
3 Strips
—
Technical Manual
1 Manual
—
備注：①Enzyme：使用前加入9 mL Diluent溶解。②Dye Reagent：使用前加入10 mL Diluent溶解。③Assay Buffer（未提供）：例如制備100 mL緩沖液，請將35 mL庚烷和65 mL異丙醇混合在一起。
操作步驟：
一、試劑和材料
1. 自備試劑：Assay Buffer（例如制備100 mL緩沖液，請將35 mL庚烷和65 mL異丙醇混合在一起。）
2. 自備材料：酶標儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機、計時器等。
二、樣品處理
1. 細胞/細菌樣品：細胞/細菌（5×106個）離心后棄上清，加入1mL 緩沖液，超聲處理（功率20%，超聲處理3s，間隔10s，重復30次）后，4℃、10 000g離心10 min，取上清轉移至新離心管中，置于冰上待檢測。
2. 組織樣品：稱取0.1g組織，加入1mL緩沖液，冰上勻漿后，4℃、10 000g 離心10 min，將上清液轉移至新的離心管中，置于冰上待檢測。
3.血清/血漿樣品：直接置于冰上待檢測。
三、標準曲線制備
用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（5 mmol/L）進行2倍連續(xù)稀釋，形成標準曲線。
四、樣品預實驗
對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內(nèi)變化。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確保讀數(shù)在標準曲線范圍內(nèi)。
五、樣品檢測
按照以下方式加樣完成后，蓋上板膠帶，混合均勻。將96孔板放入37℃的烘箱中反應10分鐘，隨后用酶標儀在500 nm下檢測吸光值。
Dye Reagent
100 μL
100 μL
100 μL
六、樣品濃度計算
樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：①標準曲線法；②公式法。
針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑，但檢測結果會更加準確。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲，因為這種反應是一個變化的過程，檢測的數(shù)值會隨著反應時間、溫度等產(chǎn)生變化。
圖1 甘油三酯檢測標準曲線示例（檢測限：0.1 mmol/L - 5 mmol/L）
常見問題解答
Q1：我想要檢測肝臟細胞在處理后，合成甘油三酯的能力是否改變，我的理解是一方面要檢測細胞內(nèi)的甘油三酯，另一方面也要檢測細胞分泌到培養(yǎng)液中的甘油三酯，那么我是不是應該把我處理后的細胞沉淀收取，培養(yǎng)上清也一并保留，這么理解對嗎？
A1：理論上是的，既然既要檢測細胞內(nèi)的又要檢測分泌出來的，那肯定是要一并保留上清和細胞的。
Q2：如果是將細胞上清收集后檢測，那么按照細胞培養(yǎng)上清樣品的檢測方法，我的培養(yǎng)上清稀釋倍數(shù)是需要通過預實驗來確定嗎？
A2：稀釋倍數(shù)都是要通過預實驗來確定的。
Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末狀，需要溶解，其中Dye Reagent說明書提示建議現(xiàn)用現(xiàn)配，那我如果想要做預實驗的話，這兩種試劑溶解后，都能夠放在-80 ℃保存嗎？
A3：這樣操作是對的，特別是酶，溶解后在-80 ℃保存最好。需要注意的是染料不管是低溫還是高溫都會氧化，建議老師預實驗做完盡早開展實驗，一次性多測些樣品，防止試劑溶解后長期儲存影響檢測效果。
Q4：TG試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數(shù)的話，可能只做幾個孔。
A4：板子不能拆分，但是可以用常規(guī)的96孔酶標板替代做預實驗。
Q5：該試劑盒可以檢測組織樣本，對組織樣本的保存有什么要求嗎？
A5：沒有什么特殊要求，新鮮或者液氮速凍的組織都可以。
參考文獻:
[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.
脂肪酸代謝系列試劑盒推薦：
貨號-規(guī)格
產(chǎn)品名稱
檢測范圍
乙醛脫氫酶檢測試劑盒
4 μmol/L - 400 μmol/L
脂肪酶檢測試劑盒
50 mmol/L - 500 mmol/L
乙醇脫氫酶檢測試劑盒
4 μmol/L - 400 μmol/L
丙酮酸脫羧酶檢測試劑盒
4 μmol/L - 400 μmol/L
甘油三酯(TG)檢測試劑盒
0.1 mmol/L - 5 mmol/L
高密度脂蛋白檢測試劑盒
0.1 mmol/L - 10 mmol/L
低密度脂蛋白檢測試劑盒
0.1 mmol/L - 10 mmol/L
總膽固醇(TC)檢測試劑盒
0.05 mmol/L - 5 mmol/L
乙酰輔酶A羧化酶檢測試劑盒
1 μmol/L - 100 μmol/L
游離脂肪酸檢測試劑盒
0.01 mmol/L - 1 mmol/L
甘油檢測試劑盒
0.1 mmol/L - 10 mmol/L
乙醇檢測試劑盒
0.01 mg/L - 10 mg/L
脂氧合酶(LOX)檢測試劑盒
0.03 mmol/L - 3 mmol/L
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