背景及概述[1][2]
活性氧包括超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等,這些粒子均十分微小。由于存在未配對的自由電子,活性氧的化學(xué)性質(zhì)十分活躍?;钚匝跬巧锷^程中的一種副產(chǎn)品,當(dāng)其過量時,機體內(nèi)的活性氧會對細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞,引發(fā)多種疾病,如細(xì)胞毒性、衰老、癌癥等。超氧陰離子是其他幾種活性氧的源頭,超氧化物歧化酶能夠清除機體中過量的超氧陰離子,它能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng),產(chǎn)生氧氣和過氧化氫,具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。
活性測定方法[1]
現(xiàn)有的測定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黃嘌呤氧化酶-NBT法、 腎上腺素自氧化法、Marklund鄰苯三酚法、化學(xué)發(fā)光法等。但是黃嘌 呤氧化酶-NBT法中,NBT產(chǎn)物甲臜水溶性差,需要加入助溶劑增加水溶 性,因此此法應(yīng)用有一定的限制。腎上腺素自氧化法和Marklund鄰苯 三酚法是根據(jù)腎上腺素和鄰苯三酚在堿性條件下自氧化,產(chǎn)生超氧陰離子和有色物質(zhì),根據(jù)有色物質(zhì)的含量變化測定超氧化物歧化酶活性 ,但是有色物質(zhì)不穩(wěn)定,存在時間短,因此測定有誤差,重現(xiàn)性較差 ?;瘜W(xué)發(fā)光法是通過使用化學(xué)發(fā)光劑使體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,間接的檢 測超氧陰離子的方法,該方法由于發(fā)光時間短暫,測定困難并易產(chǎn)生誤差,重現(xiàn)性較差。
CN201210341599.6提供一種測定超氧化物歧化酶活性的方法,該方法包括以下步驟:
步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制
配制濃度為50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH值為9.3;
步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制
用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo) 準(zhǔn)溶液,所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯 )-2H-四氮唑鈉鹽,能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料;
步驟c、對照品、樣品和空白樣品的制備
對照品的制備:反應(yīng)總體積160微升,先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺 四乙酸二鈉鹽,加入40微升生理鹽水,加入40微升50微摩爾/升的2-( 4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽,最后加入40微升1毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液,37℃反應(yīng)12分鐘后,作為對照品,供內(nèi)置紫外可見分光光度計的酶標(biāo)儀測定;
樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升,先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽,加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液(生理鹽水溶解的),加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽,最后加入40微升1毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液,37℃反應(yīng)12分鐘后,作為樣品,供內(nèi)置紫外可見分光 光度計的酶標(biāo)儀測定;
空白樣品的制備:反應(yīng)總體積160微升,先加入40微升2毫摩爾/升乙二 胺四乙酸二鈉鹽,加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (生理鹽水溶 解的),加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2' 4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽,最后加入40微升水溶液,37℃反應(yīng)12分鐘后,作為空白樣品,供內(nèi)置紫外可見分光光度計的酶標(biāo)儀測定;
步驟d、對照品、樣品和空白樣品的檢測
對照品檢測:以96孔板為載體,在內(nèi)置紫外可見分光光度計的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定,設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米,對步驟c制備的對照品進(jìn)行測定,得到對照品的吸光度值A(chǔ)對照品;
樣品檢測:以96孔板為載體,在內(nèi)置紫外可見分光光度計的酶標(biāo)儀中 進(jìn)行測定,設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米,對步驟c配制的樣品進(jìn)行測定,得到樣品的吸光度值A(chǔ)樣品;
空白樣品檢測:以96孔板為載體,在內(nèi)置紫外可見分光光度計的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測定,設(shè)定紫外-可見檢測波長為450納米,對步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測定,得到空白樣品的吸光度值A(chǔ)空白樣品;
步驟e、超氧化物歧化酶的活性的計算
超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率按照以下公式計算:
I樣品=[A對照品-(A樣品-A空白樣品)]/A對照品×100%
式中,I為超氧化物歧化酶對超氧陰離子的清除率;
A對照品為對照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮 唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值,無量綱;
A樣品為樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑 鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值,無量綱;
A空白樣品為空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四 氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值,無量綱;
超氧化物歧化酶活性的計算公式如下:
超氧化物歧化酶活性=I/(1–I)
根據(jù)測得的對照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值A(chǔ)對照品、A樣品和A空白樣品,經(jīng)計算得到0.78毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子的清除率為42%,進(jìn)而得出超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性為5.8U/μg。
分離提純[2]
一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法,其特征在于步驟如下:
步驟1:利用超聲破碎儀將細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液破碎后,離心取上清,用鹽酸調(diào)節(jié)蛋白 質(zhì)溶液pH值至酸性,0℃-4℃靜置1h-3h后,離心取上清,超濾濃縮后得到蛋白質(zhì)溶液;
步驟2:將沉淀劑溶解在0.1-5mM,pH值為3.0-5.5的檸檬酸溶液中,與蛋白質(zhì)溶液 按1:1體積比混合后,加入10-200μL籽晶,置于控溫箱中,在4℃-20℃中攪拌結(jié)晶;所述沉淀 劑為PEG8000,濃度為20-80mg/mL;
步驟3:將結(jié)晶完成后的溶液離心后取沉淀,所得沉淀即為超氧化物歧化酶晶體混合物;
步驟4:加入超氧化物歧化酶晶體清洗溶液,緩慢攪拌混勻后,離心棄上清,重復(fù)該 過程多次以徹底清洗晶體,得到超氧化物歧化酶晶體;所述晶體清洗溶液為20-100mg/mL的 PEG8000溶液;
步驟5:將所得晶體凍干,得到白色粉末狀超氧化物歧化酶成品,或不凍干,直接作為晶體制劑應(yīng)用。
對于步驟4得到的超氧化物歧化酶晶體溶解后的溶液取代步驟2的蛋白質(zhì)溶液,采用與步驟2相同的結(jié)晶條件重復(fù)結(jié)晶多次,使所制得的超氧化物歧化酶晶體純度更高。
主要參考資料
[1] CN201210341599.6 一種測定超氧化物歧化酶活性的方法
[2] [中國發(fā)明] CN201810289241.0 一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法