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超氧化物歧化酶的制備方法

2021/5/6 17:39:48

背景及概述[1]

超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)是一類氧化還原金屬酶,能清除體內(nèi)超氧自由基陰離子,有效地預(yù)防超氧自由基陰離子對機(jī)體的損害作用,是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號殺手,是生命健康之本。SOD酶廣泛分布于各種生物體內(nèi),如動物、植物、微生物等。

制備[1-2]

報道一、

從蒜片加工廢水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法:

以多個400目的不銹鋼篩網(wǎng)為支撐材料,以200目的硅藻土為過濾介質(zhì),將硅藻土料液通過泵循環(huán),預(yù)先在不銹鋼篩網(wǎng)上均勻涂上5毫米厚的硅藻土過濾層,然后對10立方蒜片加工廢水進(jìn)行過濾,除去蒜片加工廢水中的大顆粒雜質(zhì)和膠體物質(zhì);對過濾后的蒜片加工廢水打入反應(yīng)釜,加熱到75℃,加熱時間20分鐘,使蒜片加工廢水中的雜蛋白變性絮凝,冷卻至30℃,再經(jīng)硅藻土掛膜過濾后,去除蒜片加工廢水中的雜蛋白質(zhì);然后將蒜片加工廢水經(jīng)過濾澄清后,用泵打入裝有1000公斤超氧化物歧化酶(SOD)分子印跡樹脂的樹脂柱,控制進(jìn)樣流速500立升/小時,選擇性吸附廢水中的大蒜超氧化物歧化酶(SOD),大蒜多糖等雜質(zhì)隨廢水流出,實(shí)現(xiàn)了大蒜超氧化物歧化酶(SOD)與大蒜多糖等雜質(zhì)的分離;超氧化物歧化酶(SOD)分子印跡樹脂吸附飽和后,先用0.5立方去離子水沖洗樹脂,然后用200公斤洗脫劑洗脫,控制洗脫流速100立升/小時,收集到含大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的洗脫液250公斤;洗脫液經(jīng)截留分子量20000的聚砜膜濃縮至固體質(zhì)量百分比含量5%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)濃縮液50公斤;將質(zhì)量百分比含量5%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)濃縮液,經(jīng)-55℃的低溫冷凍干燥10小時后,得到粉狀大蒜超氧化物歧化酶(SOD)3公斤。

大蒜超氧化物歧化酶(SOD)提取率0.05%,大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的酶比活性2670U/mg。

報道二、

一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法,其特征在于步驟如下:

(1)利用超聲破碎儀破碎細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液(功率30%,開5s,停3s,破碎1h),12000rpm離心40min,取上清,用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH=5.0,4℃靜置1h后,12000rpm離心40min后取上清,在壓力為0.5Mpa下,用截留分子量為3KDa的超濾膜,將上清濃縮至30mg/mL;

(2)將沉淀劑溶解在0.1mM,pH3.0的檸檬酸溶液中,配制成40mg/mL的PEG8000沉淀劑溶液,按1:1的體積比加入到步驟(1)中的蛋白溶液中,混合均勻后加入200uL的籽晶,置于4℃控溫箱中攪拌結(jié)晶,攪拌速度為200rpm;

(3)將步驟(2)結(jié)晶完成后的溶液4℃、12000rpm離心30min取沉淀,所得沉淀即為超氧化物歧化酶晶體混合物;

(4)在步驟(3)中所得的溶液中加入40mg/mL的PEG8000溶液,緩慢攪拌混勻后,離心棄上清,重復(fù)該過程三次以徹底清洗晶體。

(5)以相同的結(jié)晶條件,結(jié)晶方法,重復(fù)結(jié)晶兩次以上,以得到更高純度的超氧化物歧化酶晶體。

(6)將步驟(5)所得晶體溶液冷凍干燥,得到超氧化物歧化酶純度為95%,比活力為4335U/mg。

參考文獻(xiàn)

[1][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)]CN202010360991.X超氧化物歧化酶及其制備方法、超氧化物歧化酶口服液和固體制劑

[2][中國發(fā)明]CN201810289241.0一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法

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