重組人超氧化物歧化酶是一種廣泛存在于生物體內,能清理生物體內的超氧陰離子自由基(O2-),維持機體中自由基產生和清理動態(tài)平衡的一種金屬酶。
特點
重組人超氧化物歧化酶與人體內天然存在的SOD序列相同,具有更高的人體親和力。
生產方法
市場上流通的SOD大多是從動物血液中提取的,容易受到污染,產生細菌內毒素,引起熱源性問題,研制開發(fā)重組人超氧化物歧化酶不僅可解決人源SOD來源有限和因血制品污染而帶來的安全性問題,而且可避免異源SOD在臨床應用時可能出現(xiàn)的免疫性過敏反應。傳統(tǒng)的SOD純化方法較繁瑣且費時費力,SOD產率較低、生產成本昂貴,不利于大規(guī)模的工廠化生產。因此開發(fā)其他更安全、更經濟的提取或分離方法取代傳統(tǒng)SOD生產方法具有十分重要的意義。本發(fā)明將含有人源SOD基因的工程菌進行發(fā)酵表達,高壓勻質破碎后進行熱變性,離心超濾后進行層析,克服了以現(xiàn)有技術存在的缺陷,可滿足工業(yè)化生產的需要。
本發(fā)明涉及一種重組人源超氧化物歧化酶的生產方法。屬于生物工程技術領域。該方法利用銅鹽熱變性除去大部分雜蛋白,離心后經過微濾除菌及雜質,利用超濾進行濃縮、除鹽及小分子雜蛋白,陰離子層析純化后,冷凍干燥。操作簡單,成本低廉,適用于工業(yè)生產。
具體操作步驟為:
(1)將含有人源超氧化物歧化酶基因的大腸桿菌進行發(fā)酵,發(fā)酵液用管式離心機離心,轉速:16000r/min,流速:0.6-0.8mL/min,收集菌體,按照菌體濕重與純水體積1∶10比例懸浮,用高壓勻質機破碎,破碎壓力為880bar,破碎一次;
(2)在破碎后混合液中加入2%-6%體積的10mmol/L的CuCl2溶液,通入螺旋管加熱器中進行熱變性,熱變性溫度65-80℃,時間:10-30min。離心,收集上清;
(3)膜處理,將步驟2所得上清液依次通過5μm的預處理膜、0.22μm濾膜、6kDa超濾膜;
(4)DEAE-SephadexA50柱層析,用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸鉀鹽緩沖液進行 梯度洗脫,收集具有SOD活力的洗脫液,超濾濃縮后,冷凍干燥,用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性。
參考文獻
CN103627683A