背景^[1-3]

KCNA5抗體是一種可以特異性結(jié)合KCNA5的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的KCNA5蛋白。KCNA5抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

KCNA5基因(Potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,member 5)編碼的KCNA5通道(Kv1.5鉀通道)介導(dǎo)了心房的超速激活延遲整流鉀電流(ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current,Ikur)。Ikur僅存在于心房肌,不存在于心室肌。由于房顫(atrial fibrillation,AF)的發(fā)生發(fā)展與心房Ikur的異常存在密切關(guān)系,因此目前認(rèn)為KCNA5通道蛋白是治療AF的一個(gè)理想靶點(diǎn)。FHL2由4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域組成,屬于LIM-only蛋白家族,在FHL家族中有較為深入的研究。已知FHL2通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄輔助因子等相互作用參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)錄過(guò)程,且參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

KCNA5抗體

KCNA5抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿(mǎn)tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（KCNA5抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(KCNA5抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

KCNA5抗體可以用于KCNA5蛋白與FHL2蛋白的相互作用

運(yùn)用KCNA5抗體免疫共沉淀和免疫熒光技術(shù)初步驗(yàn)證FHL2蛋白與KCNA5蛋白間的相互作用,為進(jìn)一步研究對(duì)KCNA5蛋白功能表達(dá)的調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

方法:(1)質(zhì)粒構(gòu)建:以編碼KCNA5的全長(zhǎng)cDNA為模板,通過(guò)PCR方法在其開(kāi)放讀框的兩端分別加上HindⅢ(5’端)和EcoRⅠ(3’端)兩個(gè)酶切位點(diǎn),去除末端的終止密碼;應(yīng)用HindⅢ和EcoRⅠ分別酶切pcDNA3.1/myc-His C質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物,應(yīng)用DNA連接酶將線(xiàn)性的pcDNA3.1/myc-His C和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接,得到pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5質(zhì)粒。pcDNA3.0-FHL2由導(dǎo)師提供(已經(jīng)測(cè)序鑒定)(。2)細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染:培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,應(yīng)用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5質(zhì)粒和pcDNA3.0-FHL2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。(3)免疫共沉淀:將抗FHL2特異性抗體和總蛋白進(jìn)行混合,再加入Protein A/G Plus-Agarose進(jìn)行混合,離心沉淀,將沉淀物進(jìn)行電泳,隨后應(yīng)用抗Myc抗體進(jìn)行Western Blot分析。(4)KCNA5抗體免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析:將質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后固定,應(yīng)用抗FHL2一抗(羊來(lái)源)和Alexa 488標(biāo)記的驢抗羊二抗檢測(cè)FHL2蛋白,應(yīng)用抗Myc一抗(兔來(lái)源)和Alexa 555標(biāo)記的驢抗兔二抗檢測(cè)KCNA5-Myc融合蛋白。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5質(zhì)粒,并經(jīng)測(cè)序證明KCNA5編碼的蛋白與載體的myc-His在同一讀框,堿基無(wú)突變。(2)pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和Western Blot,實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)一條約75KD大小的條帶,與KCNA5-myc-His融合蛋白大小相當(dāng),陰性對(duì)照組未見(jiàn)條帶。(3)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行KCNA5抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)后,用倒置熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)在細(xì)胞膜上KCNA5蛋白和FHL2蛋白分別發(fā)出紅色熒光和綠色熒光,二者熒光重疊部分(黃色熒光)提示這兩種蛋白在細(xì)胞上共定位。

參考文獻(xiàn)

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