背景^[1-3]

FABP1抗體是一種可以特異性結(jié)合FABP1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的FABP1蛋白。FABP1抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

FABP1基因編碼肝臟中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸結(jié)合蛋白。脂肪酸結(jié)合蛋白是一類高度保守的小細胞質(zhì)蛋白，可結(jié)合長鏈脂肪酸和其他疏水配體。這種蛋白質(zhì)和FABP6（回腸脂肪酸結(jié)合蛋白）也能夠結(jié)合膽汁酸。人們認為FABP的作用包括脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運和代謝。

FABP1抗體

FABP1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（FABP1抗體按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(FABP1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

FABP1抗體可以用于抑制FABP1表達的化合物篩選及其改善肝細胞甘油三酯蓄積的作用機制研究

研究擬利用實驗室天然小分子庫,從中篩選能夠有效抑制FABP1表達的小分子化合物,并探討目標化合物在肝細胞脂代謝中的作用及其機制,從而進一步揭示FABP1在肝臟脂代謝調(diào)節(jié)中的作用,為調(diào)節(jié)機體脂代謝紊亂提供新的潛在的候選藥物,具體如下。

一、基于FABP1啟動子的化合物篩選及鑒定我們構(gòu)建并利用p GL3-FABP1啟動子熒光素酶報告載體,通過檢測其熒光素酶活性,篩選出T5-40等9種抑制FABP1啟動子活性的小分子化合物。之后通過檢測以上小分子化合物對FABP1 m RNA和蛋白表達水平的作用,最終確認T5-40可以顯著抑制FABP1表達。二、FABP1表達抑制劑T5-40對肝細胞脂代謝的調(diào)控作用為進一步探究T5-40的生物學功能,我們通過游離脂肪酸(FFA)誘導人肝癌細胞系Hep G2細胞,建立了肝細胞脂質(zhì)沉積模型。600μM FFA導致Hep G2細胞內(nèi)FABP1表達升高,同時甘油三酯(TG)含量明顯增加,而在T5-40的作用下,顯著下調(diào)了FFA導致的肝細胞FABP1蛋白表達的升高,同時降低了肝細胞內(nèi)TG的含量。三、T5-40改善肝細胞TG蓄積的作用機制我們通過分別過表達和敲低FABP1進一步闡明T5-40降低肝細胞內(nèi)TG的含量的機制。FABP1抗體結(jié)果表明在FFA刺激下,在Hep G2細胞內(nèi)過表達FABP1,顯著逆轉(zhuǎn)了T5-40降低肝細胞TG水平的作用;而敲低FABP1,T5-40減少TG含量的作用沒有進一步明顯增強,說明T5-40下調(diào)肝細胞內(nèi)TG的作用主要是通過抑制FABP1的表達實現(xiàn)的。最后,通過檢測T5-40處理后肝細胞脂質(zhì)合成及氧化相關(guān)基因m RNA水平的變化,發(fā)現(xiàn)T5-40導致肝細胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達顯著下降。此外通過檢測T5-40處理后PPARα及HNF4α的表達情況,發(fā)現(xiàn)T5-40明顯抑制HNF4α的表達,因此推測T5-40可能是通過降低HNF4α蛋白水平進而抑制FABP1基因的轉(zhuǎn)錄。

參考文獻

[1]The role of ROS in tumour development and progression[J].Cheung Eric C.;Vousden Karen H..Nature Reviews Cancer.2022

[2]Heme-oxygenase and lipid mediators in obesity and associated cardiometabolic diseases:Therapeutic implications.[J].McClung John A;Levy Lior;Garcia Victor;Stec David E;Peterson Stephen J;Abraham Nader G.Pharmacology&therapeutics.2021

[3]DDX5 promotes oncogene C3 and FABP1 expressions and drives intestinal inflammation and tumorigenesis.[J].Abbasi Nazia;Long Tianyun;Li Yuxin;Yee Brian A;Cho Benjamin S;Hernandez Juan E;Ma Evelyn;Patel Parth R;Sahoo Debashis;Sayed Ibrahim M;Varki Nissi;Das Soumita;Ghosh Pradipta;Yeo Gene W;Huang Wendy Jia Men.Life science alliance.2020

[4]Effect and mechanism of ginsenoside Rg1-regulating hepatic steatosis in HepG2 cells induced by free fatty acid.[J].Gao Yue;;Zhang Shujun;;Li Jiajun;;Zhao Jinqiu;;Xiao Qing;;Zhu Yali;;Zhang Jia;;Huang Wenxiang.Bioscience,biotechnology,and biochemistry.2020

[5]王庚.抑制FABP1表達的化合物篩選及其改善肝細胞甘油三酯蓄積的作用機制研究[D].東北師范大學,2023.