由指狀青霉引起的綠霉病是柑橘果實采后主要病害之一。目前，柑橘綠霉病的防控手段以化學(xué)殺菌劑為主，但化學(xué)殺菌劑引起的環(huán)境、安全及病原菌耐藥性等問題日益嚴峻，因此篩選高效的綠色植物源殺菌劑具有重要意義。近年來，植物次生代謝產(chǎn)物生物堿對植物病原真菌的抑制作用引起了廣泛關(guān)注。
小檗堿是異喹啉類生物堿，鹽酸小檗堿（BH）具有廣譜抑菌性，因其多靶位抑菌機制，使致病菌不易產(chǎn)生耐藥性，常作為抗腫瘤、抗炎、抗菌成分應(yīng)用于臨床制劑。對植物病原真菌的抑制作用已有初步報道。湘潭大學(xué)果蔬貯藏與加工團隊林 波、歐陽秋麗、李 路*等人對鹽酸小檗堿抑制指狀青霉的作用機制進行初步探討，為柑橘采后綠霉病的防治提供理論依據(jù)。
01BH對指狀青霉生長情況的影響
PDB培養(yǎng)2 d后，BH濃度為0.16 g/L時可完全抑制指狀青霉的生長，表明BH抑制指狀青霉菌絲體生長的MIC值為0.16 g/L；將BH濃度≥MIC的培養(yǎng)液涂布到PDA平板繼續(xù)培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)，0.32 g/L BH可以完全抑制指狀青霉的生長，表明MFC值為0.32 g/L。
不同濃度BH處理后，指狀青霉的孢子萌發(fā)率均有所下降（圖1）。對照組指狀青霉孢子在6 h開始萌發(fā)，此時，BH 處理組的孢子均不萌發(fā)。15 h時，對照組孢子萌發(fā)率達92.48±3.35%。而0.5 MIC和1.0 MIC BH處理組的孢子萌發(fā)率分別為12.55±0.71%和4.40±1.05%，顯著低于對照組（P＜0.05）。表明BH可顯著抑制指狀青霉孢子的萌發(fā)。
02BH對柑橘果實綠霉病發(fā)病進程的影響
BH對柑橘果實綠霉病發(fā)病進程的影響如圖2所示。接種指狀青霉3 d后，對照組柑橘果實開始發(fā)病，并表現(xiàn)出明顯病癥，貯藏5 d后全果腐爛。而經(jīng)5 × MFC、10 × MFC BH處理的柑橘果實第4 d才開始發(fā)病，貯藏5 d后，10 × MFC BH處理的果實病斑直徑為1.13 ± 0.02 cm，顯著小于對照組（5.62±0.09 cm，P＜0.05）（表2）。說明BH處理延緩了柑橘果實綠霉病的發(fā)病進程，且抑制作用呈濃度依賴性。
03BH對指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響
BH處理對指狀青霉菌絲體表面形態(tài)的影響如圖3所示。120 min時，對照組菌絲體表面形態(tài)飽滿完整，無褶皺凹陷（圖3A）；而0.5 MIC BH處理組部分菌絲體呈干癟、褶皺、扭曲狀（圖3B）；1.0 MIC BH處理組菌絲的損傷程度更加明顯（圖3 C）。表明BH可破壞指狀青霉菌絲體表面形態(tài)，且處理濃度越大，菌絲體的損傷程度越明顯。
04BH對指狀青霉菌絲體細胞壁完整性的影響
指狀青霉菌絲體經(jīng)CFW染色后，1.0 MIC BH處理組的熒光強度隨處理時間的延長逐漸減弱，而對照組菌絲體的熒光強度基本不變（圖4A）。其中，30 min時，1.0 MIC BH處理組的熒光值為初始值的0.93±0.00倍，顯著低于對照組（1.00±0.01，P＜0.05，圖4B），說明此時細胞壁完整性已受損。AKP存在于細胞壁和細胞膜之間，細胞壁受損將導(dǎo)致AKP泄漏，因此進一步測定胞外AKP活力的變化對細胞壁受損情況進行驗證。結(jié)果顯示，30 min時，1.0 MIC BH處理組的胞外AKP活力為4.58±0.31 U/L，顯著高于對照組（3.68±0.09 U/L，P＜0.05）（圖4B）。說明1.0 MIC BH處理30 min時，細胞壁完整性已受損，導(dǎo)致AKP從細胞周質(zhì)空間釋放到胞外。
05BH對指狀青霉菌絲體細胞膜完整性的影響
結(jié)果表明，30 min時1.0 MIC BH處理的菌絲體呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，其熒光倍數(shù)為初始值的1.24±0.02倍，顯著高于對照組（1.02±0.05，P＜0.05），且熒光強度隨處理時間的延長而增大，而對照組未觀察到紅色熒光（圖5A-B）。進一步測定胞外電導(dǎo)率及可溶性蛋白的含量對細胞膜通透性的變化進行驗證。發(fā)現(xiàn)30 min時，0.5 MIC BH和1.0 MIC BH處理組的胞外電導(dǎo)率相對初始增量和可溶性蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05），且隨處理時間延長，胞外電導(dǎo)率相對初始增量和可溶性蛋白含量持續(xù)增加（圖5C-D）。說明0.5 MIC BH處理30 min時，壞指狀青霉菌絲體的細胞膜通透性已受損，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。值得注意的是，30 min時，0.5 MIC BH處理組的細胞膜通透性已受損，而該濃度下細胞壁完整性受損發(fā)生在30 min之后，說明細胞膜是BH最初的作用位點。
06BH對指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS和MDA水平的影響
結(jié)果如圖6所示。30 min時，BH處理組的胞內(nèi)ROS和MDA含量與對照無顯著性差異；而60 min時，1.0 MIC BH處理組ROS含量為初始值的1.040±0.027，胞內(nèi)MDA含量增加至0.171±0.007 nmol/g prot，均顯著高于對照組（P＜0.05）。說明60 min時，1.0 MIC BH處理組的指狀青霉菌絲體胞內(nèi)ROS積累并發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)。
07BH對指狀青霉線粒體膜電位及能量代謝的影響
由圖7A可知，30 min時，BH對指狀青霉菌絲體MMP沒有造成顯著影響，但處理60 min時，0.5 MIC和1.0 MIC處理組的菌絲體MMP分別為0.388±0.017、0.262±0.010，均顯著低于對照組（0.435±0.013，P＜0.05）。說明此時，線粒體功能已受損。此外，BH處理對指狀青霉菌絲體的能量代謝造成顯著影響。處理30 min時，菌絲體ATP含量迅速減少，0.5 MIC和1.0 MIC BH處理組的ATP含量分別為72.91±2.85 μg/g和76.16±0.87 μg/g，均顯著低于對照組（116.52±5.18 μg/g，P＜0.05）；處理60 min時，ATP含量進一步下降（圖7B）。胞內(nèi)能荷也呈現(xiàn)類似變化趨勢（圖7C）。結(jié)果暗示BH處理30 min時，指狀青霉菌絲體能量代謝已受影響，可能與細胞膜通透性的改變有關(guān)；60 min時，線粒體功能受損，能量代謝進一步失衡。
結(jié)論
BH能有效抑制指狀青霉的孢子萌發(fā)和菌絲生長，并延緩柑橘果實綠霉病的發(fā)病進程。BH損傷病原菌的細胞通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和能量失衡。隨后，胞內(nèi)ROS積累造成膜脂過氧化和線粒體損傷，進一步影響能量代謝，導(dǎo)致細胞凋亡。
本文《鹽酸小檗堿抑制指狀青霉的作用機制》來源于《食品科學(xué)》2022年43卷3期213-220頁，作者：林波，歐陽秋麗，余婷，鄭佳佳，陶能國，李路。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210305-068。