進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對(duì)多肽合成的要求越來越高。合成肽序越來越長(zhǎng)，而且已經(jīng)不局限于氨基酸的偶聯(lián)，很多都已集中在多肽標(biāo)記和修飾方法以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成或蛋白合成。這就對(duì)多肽合成技術(shù)提出了更高的要求。

多肽合成技術(shù)發(fā)展介紹

多肽化學(xué)已經(jīng)走過一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時(shí)多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢。當(dāng)時(shí)合成采用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相當(dāng)困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z)來保護(hù)α-氨基，該保護(hù)基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動(dòng)了有機(jī)化學(xué)合成以及保護(hù)基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量生物活性多肽，包括催產(chǎn)素，胰島素等。同時(shí)，在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績(jī)，這為后來固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也是在這個(gè)階段，F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測(cè)定方法，并為此獲得了1958年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。后來他還發(fā)明了DNA序列檢測(cè)方法，并于1980年再次獲得的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，成為目前為止唯一兩獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS),這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來，就由于其合成方便、迅速，現(xiàn)已成為多肽合成的首選方法，而且也帶來有機(jī)合成上的一次革命，并成為一支獨(dú)立的學(xué)科—固相有機(jī)合成（SPOS)。當(dāng)然，Merrifield也因此獲得了1984年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。也正是Merrifield的反復(fù)篩選，最終摒棄了芐氧羰基（Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（Boc)用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也非常迅速，在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧羰基（Boc)方法中，氨基酸側(cè)鏈保護(hù)集團(tuán)大多基于芐基（Bzl)，因此也稱為Boc-Bzl策略。同時(shí)，Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個(gè)氨基酸)。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中于固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基（Fmoc)用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全。由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧羰基（Boc)，成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（tBu)，因此也成為Fmoc-tBu策略。同時(shí)，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。

進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對(duì)多肽合成的要求越來越高。合成肽序越來越長(zhǎng)，而且已經(jīng)不局限于氨基酸的偶聯(lián)，很多都已集中在多肽標(biāo)記和修飾方法以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成或蛋白合成。這就對(duì)多肽合成技術(shù)提出了更高的要求。

多肽合成方法的分類

多肽合成方法眾多，但按大類份主要為化學(xué)合成和生物合成兩條路徑。

1、化學(xué)合成

化學(xué)合成主要是通過氨基酸脫水縮合反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。在反應(yīng)過程中，將原料中不需要參與反應(yīng)的氨基酸保護(hù)基團(tuán)臨時(shí)保護(hù)起來，從而實(shí)現(xiàn)合成的定向進(jìn)行。化學(xué)合成又分為固相和液相合成，主要區(qū)別在于是否使用固相載體樹脂。

液相合成：液相合成有兩種策略，逐步合成和片段合成。逐步合成簡(jiǎn)單迅速，適合大部分多肽合成，而片段合成有利于更大的多肽（含有超過10個(gè)氨基酸)?？傮w來說，液相方法由于污染大，反應(yīng)研發(fā)較為復(fù)雜等原因已被固相合成方法所替代。目前，由于其規(guī)模大，單位成本較低等原因仍在10個(gè)氨基酸以下的多肽合成中有較廣泛的使用。

圖1.液相合成

固相合成：固相多肽合成的原理是將氨基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然后依次進(jìn)行縮合反應(yīng)、延長(zhǎng)肽鏈。固相合成法可以細(xì)分為Fmoc法和Boc法，。相比之下，F(xiàn)moc方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)。已成為目前多肽合成的首選。但固相合成仍存在反應(yīng)效率相對(duì)較低、規(guī)模化難度高、成本偏高等問題。

圖2.固相合成 

在兩種傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，多肽合成技術(shù)又逐步衍生出羧內(nèi)酸苷法（NCA)、組合化學(xué)法、自然偶聯(lián)法等。

NCA法：氨基酸的羧內(nèi)酸苷法是一種氨基酸衍生物。NCA法基于陰離子開環(huán)聚合原理，可通過堿類等引發(fā)反應(yīng)。NCA法反應(yīng)：在堿性條件下，氨基酸陰離子進(jìn)攻NCA形成氨基甲酸根離子，酸化時(shí)該離子失去二氧化碳形成二肽，該二肽又在堿性條件下形成陰離子進(jìn)攻其他的NCA，如此反復(fù)進(jìn)行下去。此方法用于多肽的重磅產(chǎn)品格拉替雷的合成。

組合化學(xué)法：該方法是在固相多肽合成的基礎(chǔ)上提出來的，即氨基酸的構(gòu)建單元通過組合的方式連接，合成出含有大量化合物的庫(kù)，從中篩選出理化性質(zhì)或者藥理活性一致的化合物。組合化學(xué)法在發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)物方面有極大優(yōu)勢(shì)。

液相分段合成法：該方法時(shí)基于多肽片段能夠在溶液中化學(xué)選擇性的自發(fā)連接合成長(zhǎng)多肽的特點(diǎn)。常用的連接技術(shù)包括天然化學(xué)連接（NCL)、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學(xué)連接等。

2、生物合成

生物合成主要包括酶解法、基因工程法、發(fā)酵法和酶催化法。

酶解法：利用生物酶降解大分子動(dòng)物或植物蛋白，獲得小分子肽。但該方法很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，原因在于產(chǎn)量低、污染加大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等。

基因工程法：該方法基于DNA重組技術(shù)，通過DNA序列來控制多肽序列的生產(chǎn)。該方法的優(yōu)勢(shì)是定點(diǎn)性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低、安全環(huán)保等。該方法同樣面臨研發(fā)與生產(chǎn)設(shè)備投入大、研發(fā)周期長(zhǎng)、無法表達(dá)非天然氨基酸等缺陷。

發(fā)酵法：發(fā)酵法是利用微生物代謝獲得多肽。特點(diǎn)是成本低，但目前為止，還少有能夠產(chǎn)業(yè)化通過特定微生物發(fā)酵獲得特定多肽的案例。但發(fā)酵方法可以說是生物合成方法的基礎(chǔ)，無論是基因工程法還是合成生物學(xué)，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時(shí)均有賴于發(fā)酵法的應(yīng)用。發(fā)酵法未來的應(yīng)用將非常廣泛。

圖3.發(fā)酵法 

酶催化法：酶催化具有活性高、專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，十分適合多肽序列的合成。隨著今年來合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)酶結(jié)構(gòu)改造技術(shù)的成熟及構(gòu)效關(guān)系的逐步了解。對(duì)于酶的應(yīng)用也越來越得到重視。目前，已有谷胱甘肽、肌肽等產(chǎn)品能夠應(yīng)用酶催化方法進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。酶催化反應(yīng)具有綠色環(huán)保、產(chǎn)業(yè)化成本低廉等優(yōu)勢(shì)，但同樣存在研發(fā)難度大、周期長(zhǎng)等缺陷。

多肽合成新技術(shù)介紹

經(jīng)過多年發(fā)展，多肽合成的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)已經(jīng)逐步成熟。5個(gè)氨基酸以下適用于液相合成，5-40個(gè)氨基酸選用固相合成更合適，40個(gè)氨基酸以上采用生物合成方法更佳已逐步成為一種共識(shí)。通過傳統(tǒng)的合成方法，目前已經(jīng)能夠比較容易的規(guī)?；糠纸Y(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的多肽產(chǎn)品。但不得不承認(rèn)，目前的多肽合成方法還遠(yuǎn)不能算是完善，每種不同方法均還存在不同程度上的缺陷。本文將著重介紹部分具有產(chǎn)業(yè)化前景的多肽合成新方法。

1、天然化學(xué)連接（NCL)

天然化學(xué)連接或NCL是化學(xué)連接領(lǐng)域的重要擴(kuò)展，化學(xué)連接領(lǐng)域是構(gòu)建由兩個(gè)或多個(gè)未保護(hù)的肽段組裝而成的大多肽的概念。特別是，NCL是用于合成天然骨架蛋白或中等大小修飾蛋白（即小于200 AA的小蛋白)的最有效的連接方法。天然化學(xué)連接使用非保護(hù)的多肽片段，不需要酶及化學(xué)偶聯(lián)試劑的活化,通常在水溶液中就可完成的多肽合成反應(yīng)。

1953年，西奧多·威蘭德（Theodor Wieland)和他的同事發(fā)現(xiàn)了纈氨酸-硫酯與半胱氨酸氨基酸在水性緩沖液中的反應(yīng)可產(chǎn)生二肽纈氨酸-半胱氨酸的化學(xué)基礎(chǔ)。反應(yīng)通過含有半胱氨酸殘基硫的硫酯進(jìn)行。Wieland的工作導(dǎo)致了一種“活性酯”方法，該方法用于在有機(jī)溶劑中的常規(guī)溶液合成中制備受保護(hù)的肽段。

在1990年代，Scripps研究所的Stephen Kent及其同事獨(dú)立開發(fā)了“天然化學(xué)連接”，這是種連接大的未保護(hù)肽片段的實(shí)用方法。

最早的NCL方法的局限性是它固有地依賴在連接點(diǎn)具有半胱氨酸殘基。半胱氨酸相對(duì)不常見，僅占蛋白質(zhì)所有殘基的1.7％。因此方法的應(yīng)用受到了極大的限制。隨后，眾多研究者在NCL方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，意圖擴(kuò)展應(yīng)用領(lǐng)域。這類連接反應(yīng)一般對(duì)原料的N端和C端間的化學(xué)結(jié)構(gòu)有特定要求，由特定的N端和C端間的化學(xué)選擇性反應(yīng)得到連接產(chǎn)物。

1.1、通過酯交換反應(yīng)進(jìn)行連接

這是由C端為硫酯的多肽片段與N端含有自由巰基或硒基的片段反應(yīng)，在連接微店形成酰胺鍵，得到與天然多肽和蛋白質(zhì)一致的骨架。該連接反應(yīng)至少經(jīng)過兩個(gè)步驟，即硫酯交換捕獲和?；w移反應(yīng)，在連接位點(diǎn)可以生成的氨基酸殘基。

1.1.1 生成Cys的連接

Kent的小組在1994年首先發(fā)展了連接位點(diǎn)得到Cys的多肽連接方法，他們將方法稱之為“天然化學(xué)連接”。它是由C端為硫酯的多肽片段與N端為Cys的片段在pH值7.6的磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)得到的。首先Cys的側(cè)鏈巰基與硫酯發(fā)生酯交換反應(yīng)生成新的硫酯中間體，該中間體迅速通過五元環(huán)過渡態(tài)進(jìn)行分子內(nèi)的S→N?；w移反應(yīng)得到以Cys殘基連接的多肽終產(chǎn)物。這是目前最簡(jiǎn)單和實(shí)用的多肽片段連接方法。Kent等人利用該方法首先制備了含有72個(gè)氨基酸殘基的人白介素L-8蛋白。

圖4.Cys的連接

 1.1.2 生成Met的連接

利用N端為高半胱氨酸（Hcy)的多肽和肽硫酯交換，經(jīng)過六元環(huán)過渡態(tài)S→N酰基遷移反應(yīng)后得到位點(diǎn)為Hcy的產(chǎn)物，再用甲基化試劑如對(duì)硝基苯磺酸甲酯修飾可以再連接位點(diǎn)生產(chǎn)Met。Tam等利用該方法合成了含有34個(gè)殘基的副甲狀腺激素。

1.1.3 生成Gly的連接

Low等人在N端氨基上引入1-氨基-2-巰基結(jié)構(gòu)的輔助基團(tuán)，進(jìn)行硫酯交換并發(fā)生S→N酰基遷移反應(yīng)后，用酸脫除輔助基團(tuán)，即可獲得連接位點(diǎn)為Gly殘基的產(chǎn)物。他們用該方法合成了含有106個(gè)氨基酸殘基的細(xì)胞色素b562。

上述連接反應(yīng)中，如果原料序列中間包括Cys殘基，其側(cè)鏈巰基雖然能夠發(fā)生硫酯交換反應(yīng)形成硫酯中間體，但這些中間體經(jīng)逆反應(yīng)仍可轉(zhuǎn)化為原料，只有N端Cys/Sec生成的中間體能夠發(fā)生?；嘏欧磻?yīng)得到穩(wěn)定的酰胺鍵連接的產(chǎn)物。

1.2 通過亞胺進(jìn)行連接

這是由肽醛與另一肽段的N端氨基進(jìn)行連接，這類反應(yīng)形成的連接點(diǎn)不一定是天然氨基酸殘基。一類反應(yīng)連接處停止在亞胺結(jié)構(gòu)，如生成肟和腙；另一類由亞胺可以進(jìn)一步反應(yīng)得到雜環(huán)，如連接點(diǎn)生成噻唑烷和四氫-β-咔啉環(huán)；還有生成噻唑烷或噁唑烷之后，?；l(fā)生遷移得到酰胺產(chǎn)物，如生成類脯氨酸的連接。

1.2.1 生成Ser/Thr的連接

香港大學(xué)李學(xué)臣教授發(fā)展了基于N端絲氨酸/蘇氨酸殘基的新型多肽連接反應(yīng)（縮寫為STL)。該反應(yīng)是重要的基于N端非修飾氨基酸殘基且于位點(diǎn)處形成天然肽鍵的多肽連接方法之一。由于自然界中Ser/Thr所占比例遠(yuǎn)大于Cys，因此此方法拓展了NCL的應(yīng)用范圍。其連接反應(yīng)是利用C端水楊醛酯與N端Ser/Thr發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。

圖5.Ser/Thr的連接

1.2.2 生成類脯氨酸的連接

Tam等人發(fā)展類脯氨酸連接反應(yīng)是由C端肽乙醛酯與N端為Cys、Ser、Thr的肽段相連接。首先乙醛酯與N端氨基形成亞胺，緊接著巰基或羥基對(duì)亞胺進(jìn)行Michael加成得到噻唑烷或噁唑烷，最后?；?jīng)過五元環(huán)過渡態(tài)發(fā)生S/O→N遷移反應(yīng)生成更為穩(wěn)定的以酰胺鍵存在的硫雜類脯氨酸（SPro)或氧雜類脯氨酸（OPro)產(chǎn)物。在該連接中，側(cè)鏈氨基即使生成亞胺，也會(huì)發(fā)生逆反應(yīng)回到原料，因而不參與競(jìng)爭(zhēng)。

1.2.3 生成噻唑烷的連接

若原料肽醛片段C端為乙醛酯以外的醛時(shí)，在N端Cys連接后，因不能經(jīng)過五元環(huán)過渡態(tài)發(fā)生酰基重排反應(yīng)，反應(yīng)的連接位點(diǎn)停留在噻唑烷結(jié)構(gòu)。

圖6. 噻唑烷的連接

1.2.4 生成四氫-β-咔啉的連接

Pictet-Spengler 反應(yīng)是由酸催化的醛酮與色氨酸或色氨縮合生成雜環(huán)四氫-β-咔啉衍生物的反應(yīng),被廣泛用于異喹啉及吲哚類似物的合成。Li等人應(yīng)用該反應(yīng), 用肽醛與N端為色氨酸(Trp ) 的多肽片段在冰乙酸中反應(yīng)24h, 幾乎可以定量地得到長(zhǎng)度為17 和18 個(gè)殘基的連接產(chǎn)物, 連接位點(diǎn)為四氫-β-咔啉環(huán)，反應(yīng)中新生成的手性碳原子以兩種構(gòu)型存在，比例接近1：1。

圖7.四氫-β-咔啉的連接

1.3 通過硫醚和硫酯進(jìn)行連接

巰基被烷基化生成硫醚的反應(yīng)可以用來選擇性地修飾蛋白質(zhì)。以硫醚連接多肽時(shí)反應(yīng)在Cys 側(cè)鏈巰基與鹵代物衍生的多肽之間進(jìn)行, 通?？稍诠滔嗪铣啥嚯牡腘 端偶聯(lián)氯乙酸或溴乙酸得到鹵代多肽, 多肽鏈中所有的巰基均可以反應(yīng)。生成硫醚的反應(yīng)速率隨pH 值增加而增加, 但在堿性條件下巰基易氧化形成二硫鍵, 同時(shí)鹵代物的水解速度也變快, 因此反應(yīng)一般在pH7. 5-8.0之間進(jìn)行, 并加入TCEP 抑制二硫鍵的形成。Robey、Lu及Beekman 等人分別利用生成硫醚的連接方法制備了多肽、多肽樹狀化合物及多肽抗原。

2、特色載體

自固相多肽合成方法發(fā)明后，由于其操作簡(jiǎn)便、相對(duì)綠色環(huán)保、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)迅速推廣開來，成為目前多肽合成最為主流的方案。但由于固相采用的是不溶性載體，整個(gè)反應(yīng)是非均相反應(yīng)，其又不可避免的存在反應(yīng)效率較低，規(guī)?；щy等問題。許多多肽產(chǎn)品采用固相合成方法的單批規(guī)模甚至沒有到達(dá)公斤級(jí)。因此，許多研究者都在尋找更為合適的特色載體，能夠在保持固相優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上結(jié)合液相的優(yōu)勢(shì)。實(shí)現(xiàn)更綠色、更簡(jiǎn)便、更易規(guī)?；亩嚯暮铣煞椒?。

2.1小分子載體

近日，西北工業(yè)大學(xué)欽傳光教授課題組發(fā)展了新型有機(jī)磷小分子作為綠色多肽合成載體（GPS)，成功地實(shí)現(xiàn)了藥物分子普卡那肽（Plecanatide，商品名稱：Trulance)的液相全合成。該方法采用了無樹脂合成策略來合成長(zhǎng)鏈雙環(huán)的普卡那肽，并驗(yàn)證了通過調(diào)控和優(yōu)化DDK衍生物，在有機(jī)磷小分子載體上完全可以以無樹脂的方式合成目標(biāo)產(chǎn)物。值得一提的是，在不需色譜分離的情況下，利用載體輔助沉淀（SAP)技術(shù)，省略了多肽合成過程中各中間體純化的手續(xù)，顯著地簡(jiǎn)化了繁瑣的多肽合成步驟，提高了反應(yīng)的可行性和合成效率，很可觀地避免了過量使用溶劑和原材料。 

圖8.小分子載體1

圖9.小分子載體2

2.2  聚乙二醇聚合物

Han等用MeO-PEG-OH作為可溶性載體合成了含α-氮雜氨基酸的類肽，總收率達(dá)到56.7%。Bayer用PEG10000支載合成了五肽，每一步產(chǎn)率大于99%，無外消旋體產(chǎn)生，光學(xué)純度達(dá)到100%，反應(yīng)完成后，可通過沉淀和結(jié)晶分離純化產(chǎn)物，簡(jiǎn)單、快捷。

2.3 離子液體

離子液體( Ionic Liquids，ILs) 是完全由陰陽(yáng)離子組成的室溫下為液態(tài)的鹽，陰陽(yáng)離子可以自由振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)甚至平動(dòng)，整個(gè)有序的晶體結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致室溫下呈現(xiàn)液態(tài)。離子液體為綠色溶劑、可循環(huán)使用，具有分子溶劑不可比擬的獨(dú)特性能，對(duì)大量無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)包括強(qiáng)極性氨基酸表現(xiàn)出良好的溶解能力，具有溶劑和催化劑的雙重功能，可作為多肽反應(yīng)介質(zhì)或活性載體。通過改變陰、陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)組成或?qū)ΨQ性等途徑可以設(shè)計(jì)不同性質(zhì)的離子液體，這種可設(shè)計(jì)性進(jìn)一步拓寬了其應(yīng)用范圍。離子液體甚至可以改變反應(yīng)機(jī)理，誘導(dǎo)出新的催化活性，提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和選擇性。目前，離子液體在多肽化學(xué)方面的研究 引起化學(xué)家們的廣泛關(guān)注。

2.3.1  固相支載型離子液體的肽合成

2017年，Upadhyayula等研究將離子液體嫁接到固體樹脂上，發(fā)展聚苯乙烯樹脂支載型離子液體( PSILs)。為進(jìn)一步提高聚苯乙烯樹脂負(fù)載量，選取了基于二乙醇胺( DEA) 結(jié)構(gòu)功能的離子液體，并采用含 1%二乙烯苯( DVB) 的 PS 樹 脂，提高溶脹性能。通過氯甲基 PS( PS-Cl) 的取代反應(yīng)，將二乙醇胺引入到PS 樹脂，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的功能化固相支載型離子液體。

利用得到PS支載型離子液體，分別合成了二肽( Phe-Leu-OH) 和五肽Leu-enkephalin( Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) 。收率與純度指標(biāo)都明顯高于普通固相合成法，二肽產(chǎn)物最高收率98%，五肽產(chǎn)物最高純度 96%。離子液體的兩性特性有利于反應(yīng)試劑在樹脂表面更好地分散，這對(duì)提高反應(yīng)效率起到至關(guān)重要的作用。另外，功能化離子液體的側(cè)鏈上設(shè)計(jì)有多個(gè)自由羥基，可以滿足2～3 倍物質(zhì)的量的氨基酸負(fù)載，大幅提高了固相樹脂負(fù)載量。此外，離子液體本身所提供的靜電環(huán)境，對(duì)增長(zhǎng)的肽鏈起到了很好的穩(wěn)定作用，有助于獲得更高產(chǎn)率和更高純度的多肽產(chǎn)物。固相支載型離子液體充分結(jié)合了固相合成優(yōu)勢(shì)與離子液體功能，成倍增加了負(fù)載量，顯著提高了溶脹性能，大幅改善了團(tuán)聚現(xiàn)象，有效克服固相合成法的缺陷，在產(chǎn)物收率和產(chǎn)品純度方面都明顯優(yōu)于一般固相法，為多肽合成提供了更有效方法。

2.3.2 肽的綠色合成

2013年，Plaquevent等報(bào)道了采用離子液體策略合成肽的新方法。該方法巧妙結(jié)合離子縮合試劑與離子液體功能，反應(yīng)中產(chǎn)生的乙基咪唑三氟磺酸鹽副產(chǎn)物為離子液體，充當(dāng)反應(yīng)溶劑，除了副產(chǎn)物二氧化碳外，實(shí)現(xiàn)了肽合成的零排放。該綠色合成法設(shè)計(jì)選用1，1-羰基二( 3-乙基咪唑)三氟甲磺酸鹽(CBEIT)作為構(gòu)建肽鍵的縮合劑，反應(yīng)過程中釋放產(chǎn)生的乙基咪唑三氟甲磺酸鹽(［H-EIM］［TfO］) 具有較低熔點(diǎn)和合適黏度，是理想的離子液體。該離子液體室溫下具有良好的流動(dòng)性，因此，合成反應(yīng)中無需添加任何溶劑，可借此實(shí)現(xiàn)無溶劑反應(yīng)。

圖10. 肽的綠色合成

3、酶催化反應(yīng)

酶催化合成由于其具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)被成為新一代的合成技術(shù)。目前，酶催化也開始逐步在多肽合成中開始應(yīng)用，也出現(xiàn)了部分采用全酶催化方法合成的短肽的案例。而隨著酶定向進(jìn)化技術(shù)的發(fā)展，酶催化反應(yīng)也必然在多肽合成領(lǐng)域有著更廣泛的應(yīng)用。

3.1、酶催化環(huán)肽的合成

酶催化的環(huán)肽合成是近年來興起的一種新型環(huán)肽合成方法，該法具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、合成效率高等優(yōu)點(diǎn)，另外酶催化的環(huán)肽合成還可以在肽鏈中引入非天然氨基酸或非氨基酸結(jié)構(gòu)，進(jìn)而大大豐富了環(huán)肽結(jié)構(gòu)。

3.1.1  分選酶Sortase A

分選酶A(Sortase A)是從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分離出來的一種轉(zhuǎn)肽酶，能特異地識(shí)別肽C端的保守序列LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly；X代表任1種氨基酸)，并從蘇氨酸和甘氨酸之間使肽鍵斷裂，形成?；?底物復(fù)合物，N端帶有多聚甘氨酸的親核基團(tuán)進(jìn)攻復(fù)合物，最終形成連接產(chǎn)物。該酶基因工程表達(dá)產(chǎn)率較高(232 mg/L)，易于獲取，已廣泛地用于蛋白連接或蛋白標(biāo)記、細(xì)胞表面的蛋白標(biāo)記和蛋白環(huán)化。

圖11. 分選酶Sortase A

3.1.2 肽連接酶Butelase-1

蝶豆蘭花肽連接酶-1(Bunga telang plus ligase，Butelase-1)是一種天冬酰胺內(nèi)切蛋白酶(asparaginylendoproteases，AEP)，參與熱帶藥用植物蝶豆中大環(huán)肽合成。2014年由TAM課題組首次從碟豆中分離出來，能識(shí)別肽鏈C端三肽序列D/N-HV，并從組氨酸前面進(jìn)行肽鍵的斷裂，釋放HV二肽序列并形成?；傅孜飶?fù)合物，隨后的N端氨基酸作為親核基團(tuán)進(jìn)攻復(fù)合物重新形成肽鍵，產(chǎn)物中連接位點(diǎn)只留下D/N印跡(分選酶A為L(zhǎng)PXTG)。蝶豆蘭花肽連接酶-1對(duì)底物N端第1，2位氨基酸有一定要求，第1位氨基酸可以為除Pro、Asp和Glu以外的任何天然氨基酸，第2位為疏水性氨基酸Ile、Leu、Val以及Cys。

圖12.肽連接酶Butelase-1

引用資料

1. 麻遠(yuǎn)、趙玉芬，多肽片段連接方法及肽硫酯和肽醛的合成，化學(xué)進(jìn)展，2003，15（5)：393-400

2. Haidi Li , Jie Chao, Zixin Zhang, Guang Tian , Jun Li , Ninghui Chang, Chuanguang Qin，Liquid-Phase Total Synthesis of Plecanatide Aided by Diphenylphosphinyloxyl Diphenyl Ketone (DDK) Derivatives，Org Lett，22(9)，3323-3328

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4. 凌青，張傳主，劉玉強(qiáng)，郭彩宏，李召良，離子液體在多肽化學(xué)中的研究進(jìn)展，化學(xué)試劑，2018，40(9),841-846

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7. Marcel Schmidt，Ana Toplak，Henrieette J. Rozeboom，Hein J. Wijma，Peter J. L. M. Quaedflieg，Jan H. van Maarseveen，Dick B. Janssen，Timo Nuijens，Design of a substrate-tailored peptiligase variant for the efficient synthesis of thymosin-α1，Org. Biomol. Chem., 2018,16, 609-618