背景^[1-3]

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠抑瘤素M(OSM)水平。用純化的小鼠抑瘤素M(OSM)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入抑瘤素M(OSM)，再與HRP標記的抑瘤素M(OSM)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抑瘤素M(OSM)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠抑瘤素M(OSM)濃度。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒檢測前準備工作：

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象；放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)晶完全溶解后再配置洗滌液?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2．設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

3．樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒實驗結(jié)果計算：

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

應(yīng)用^[4][5]

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒可以用于重組人OSM的制備及誘導(dǎo)肝癌細胞分化的實驗研究

抑瘤素M(OSM)能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細胞,如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺腺癌、白血病細胞發(fā)生形態(tài)和/或功能上的分化成熟。OSM對胚胎及成體肝臟均具有獨特的生物學作用。鑒于此,本研究圍繞OSM對肝癌細胞的誘導(dǎo)分化作用進行了如下工作。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了畢赤酵母真核表達載體pPICZαC-hOSM,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33,篩選出能夠穩(wěn)定高效分泌表達重組人OSM(rhOSM)的工程菌。經(jīng)SDS-PAGE、Western Blot、N-末端15個氨基酸殘基序列分析、AKTA explorer多功能純化系統(tǒng)純化、質(zhì)譜測定其相對分子質(zhì)量及體外活性檢測,證明應(yīng)用畢赤酵母表達系統(tǒng)分泌表達的rhOSM與天然OSM具有相同的理化性質(zhì)和生物學活性。利用80 L發(fā)酵罐進行rhOSM中試規(guī)模發(fā)酵,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,rhOSM表達量達到280 mg·L-1。同時建立了一種分離純化rhOSM的新方法。利用光鏡、透射電鏡、MTT、RT-PCR、小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒、免疫熒光、免疫細胞化學染色、流式細胞術(shù)等方法和技術(shù),體外水平觀察rhOSM對人肝癌細胞SMMC-7721生長的抑制作用、細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)分子、細胞周期和凋亡率的影響及誘導(dǎo)肝癌細胞分化的相關(guān)生化指標的檢測。結(jié)果表明rhOSM能夠抑制SMMC-7721細胞生長、誘導(dǎo)其分化、促進其凋亡。通過觀察rhOSM對BALB/c小鼠肝癌細胞H22皮下移植瘤生長的抑制情況、外周血中AFP水平、瘤組織病理學改變,表明rhOSM對小鼠肝癌細胞具有抑制生長、促進分化的作用。實驗結(jié)果同時表明,短期腹腔注射rhOSM對小鼠肝臟、脾臟沒有造成損傷,但對小鼠胸腺組織具有抑制作用。

參考文獻

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