背景^[1-3]

人食管癌細胞來自人食管中段鱗癌組織，小塊法原代培養(yǎng)建系。BALB/c裸鼠移植成瘤。

食道癌又叫食管癌，是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。食道癌分早、中、晚期；通常治療方法有手術治療、化療治療、藥物治療；食道癌飲食以營養(yǎng)豐富、易于消化的食物為主。其發(fā)生病因與亞硝胺慢性刺激、炎癥與創(chuàng)傷，遺傳因素以及飲水、糧食和蔬菜中的微量元素含量有關。

人食管癌細胞

培養(yǎng)步驟：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應用^[4][5]

用于自噬介導人食管癌細胞對順鉑耐藥的作用及其機制研究

通過western blot、免疫熒光法、流式細胞儀檢測酸性囊泡、透射電子顯微鏡法、小分子干擾RNA（siRNA）、流式細胞儀檢測細胞凋亡、SA-beta-gal檢測細胞衰老、MAPKs和mTORC1通路活性檢測、克隆存活實驗和食管癌耐藥細胞裸鼠移植瘤模型等技術,深入研究自噬在人食管癌細胞對順鉑耐藥中的作用及其分子機制。

1. Western blot檢測LC3-Ⅱ和p62的表達水平

（1）檢測自噬組成蛋白微管相關蛋白輕鏈3（LC3）表達水平,LC3存在兩種可相互轉化的形式即LC3-Ⅰ和LC3-II。LC-II定位于前自噬體和自噬體,是自噬體的標志分子,隨自噬體膜的增多而增多。為了確定是自噬的發(fā)生而不是自噬過程（autophagy flux）受阻而引起LC3-Ⅱ的增加,我們擬將自噬溶酶體形成抑制劑CQ,bafilomycin A1與順鉑聯(lián)合處理細胞,觀察與順鉑單獨處理細胞后LC3-Ⅱ表達的差異。

（2）檢測自噬底物蛋白p62的表達水平,p62參與自噬的過程并在自噬溶酶體中降解,因此,p62蛋白水平與自噬活性成反比。具體方案為藥物處理細胞后,按一系列時間點（0-48h）用RIPA裂解液裂解細胞收集蛋白,BCA測定蛋白濃度后,以50μg蛋白量上樣后SDS-PAGE電泳,然后濕法轉膜轉印至PVDF膜,5%脫脂牛奶或BSA室溫封閉1h,一抗（p62和LC3,均購自cell signaling公司）4℃孵育過夜,洗膜,加二抗,室溫孵育1h,洗膜,ECL發(fā)光,顯影,定影。

2.免疫熒光共聚焦檢測LC3的分布和表達在進行免疫電鏡時,樣品的準備和固定是免疫電鏡成敗的關鍵。取對數(shù)生長期的EC109和EC109/CDDP細胞,以1×105/well接種于35mm共聚焦培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24h,吸棄培養(yǎng)基,藥物組分為四組：1)空白對照組；2)cisplatin2.5μM;3)CQ50μM;4)cisplatin2.5μM+CQ50μM。藥物處理48h后吸棄培養(yǎng)基。用PBS洗三遍（每遍5mmin）后,用4%多聚甲醛在室溫下固定15min,用PBS洗三遍（每遍5mmin）。10%山羊血清室溫封閉1h,兔源LC3一抗4℃孵育過夜,用PBS洗三遍（每遍5min）,加熒光抗兔二抗Alexa Fluor488IgG,室溫避光孵育1h,用PBS洗三遍（每遍5min）,用DAPI室溫避光染色5min,用PBS洗三遍（每遍5min）,最后一次保留PBS于培養(yǎng)皿中,顯微鏡下觀察拍照。

3.吖啶橙（Acridine Orange,AO）染色檢測酸性囊泡取對數(shù)生長期耐藥食管癌細胞EC109/CDDP,以1×105/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)24h,吸棄培養(yǎng)基,加入2.5μM順鉑藥物處理48h后,用4%多聚甲醛固定,干燥,加入終濃度為1μg/ml吖啶橙染液,染色5-10min,用PBS漂洗,在熒光顯微鏡下觀察。由于酸度的不同,自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光的細胞質囊泡（酸性囊泡）,而核染成綠色。

4.流式細胞儀檢測酸性囊泡取對數(shù)生長期耐藥食管癌細胞EC109/CDDP,以1×105/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)24h,吸棄培養(yǎng)基,加入2.5μM順鉑藥物處理48h后,加吖啶橙（acridine orange）到各組EC109/CDDP細胞中,吖啶橙終濃度為1μg/ml,正常培養(yǎng)條件下孵育15min。移去培養(yǎng)基,用PBS洗1次。0.25%胰蛋白酶消化吹打細胞,1.5ml的PBS懸浮細胞,離心1500rpm×5rain。棄上清,0.5ml PBS重懸細胞,保持樣本在冰上。然后上樣,用流式細胞儀（BD FACSCanto TMⅡflow cytometry,BD Biosciences,CA）檢測,用FlowJo7.6軟件分析。流式細胞儀檢測到藍色（488nm）激發(fā)光照射細胞后可見綠色（510～530nm）和紅色（650nm）的熒光發(fā)出。

5.透射電子顯微鏡取對數(shù)生長期的EC109和EC109/CDDP細胞,以1×x106/dish接種于60mm培養(yǎng)皿中。2.5μM順鉑處理48h后,用細胞刮收集細胞,4℃常規(guī)低速離心10min,棄上清液。細胞沉淀以2.5%的戊二醛溶液固定過夜,再以1%四氧化鋨溶液處理固定細胞2次,每次1h。最后采用梯度乙醇溶液脫水后以環(huán)氧樹脂812包埋細胞,制成超薄切片（100nm厚）。用飽和的醋酸雙氧鈾溶液和醋酸鉛染色后,在透射電子顯微鏡下觀察細胞并攝片,觀察細胞自噬體的形成。

參考文獻

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[2]Autocrine VEGF Signaling Promotes Proliferation of Neoplastic Barrett’s Epithelial Cells Through a PLC-Dependent Pathway[J].Qiuyang Zhang,Chunhua Yu,Sui Peng,Hao Xu,Ellen Wright,Xi Zhang,Xiaofang Huo,Edaire Cheng,Thai H.Pham,Kiyotaka Asanuma,Kimmo J.Hatanpaa,Davood Rezai,David H.Wang,Venetia Sarode,Shelby Melton,Robert M.Genta,Stuart J.Spechler,Rhonda F.Souza.Gastroenterology.2014(2)

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[5]古春萍.自噬介導人食管癌細胞對順鉑耐藥的作用及其機制研究[D].南方醫(yī)科大學,2014.