背景及概述

5-羧基熒光素是一種化學(xué)物質(zhì)，分子式是C21H12O7。

應(yīng)用 ^[1]

5-羧基熒光素用于制備一種真菌熒光染色液：隨著醫(yī)療檢驗(yàn)水平的不斷推進(jìn)，近年來真菌熒光染色臨床檢驗(yàn)技術(shù)逐漸推廣，目前市場上大多采用細(xì)胞壁β-多糖、幾丁質(zhì)等熒光染色法，該方法只通過熒光染料與細(xì)胞壁 β-多糖、幾丁質(zhì)等以親和力結(jié)合，不具有特異性；隨著臨床逐漸推廣發(fā)現(xiàn)，易受到染色底物雜質(zhì)的干擾，影響觀察結(jié)果的判斷；另外，熒光衰退較快，樣本無法保存；這給臨床推廣及應(yīng)用造成非常大的困擾。

針對醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)中病原菌生物學(xué)檢驗(yàn)，為能夠快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)致病真菌，CN201710899393.8提供一種真菌熒光染色液以5-羧基熒光素與真菌引物ITS4結(jié)合形成熒光引物，與真菌核糖體核糖核酸基因間隔(ITS)區(qū)堿基發(fā)生特異性的結(jié)合將真菌標(biāo)記熒光，用熒光顯微鏡 在480nm波長下鏡檢觀察背景為黑色，真菌發(fā)射出520nm波長的綠色熒光。CN201710899393.8提供一種真菌熒光染色液，由以下重量份(％)的原料組成：

制備方法包括以下步驟：

1)用電子天平準(zhǔn)確稱取5-羧基熒光素、真菌引物ITS4、水于500ml三角燒瓶中，用 玻璃棒輕輕攪拌充分溶解后，再稱取氫氧化鉀倒入燒瓶中，輕輕攪拌充分溶解后蓋上塞子；

2)將上述溶液放置于37℃恒溫?fù)u床，緩慢振搖1小時(shí)取出，此為溶液1；

3)用電子天平準(zhǔn)確稱取甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸、水于1L三角燒瓶中，用玻 璃棒攪拌充分溶解，此為溶液2；

4)將溶液1緩慢倒入溶液2中，邊倒入邊攪拌使其充分混合后，即得本發(fā)明真菌熒 光染色液，置于棕色瓶中保存。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過將上述原料按重量份配制成熒光染色液，熒光染色液 中5-羧基熒光素的羧基與真菌核糖體核糖核酸間隔區(qū)引物4(ITS4)的核苷酸鏈兩端的磷酸 基團(tuán)端氨基殘基共價(jià)結(jié)合標(biāo)記成熒光引物，在游離狀態(tài)時(shí)該熒光引物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)避免5- 羧基熒光素衰退，在氫氧化鉀溶液中快速進(jìn)入真菌細(xì)胞與真菌核糖體核糖核酸基因間隔區(qū) (ITS)堿基發(fā)生特異性的結(jié)合，此時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，露出5-羧基熒光素將真菌細(xì)胞標(biāo)記熒 光，另外，甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸形成的抗熒光衰退保護(hù)層將露出5-羧基熒光素封 閉式包裹阻止熒光衰退，使真菌樣本能長期保存，用熒光顯微鏡在480nm波長下鏡檢觀察背 景為黑色，真菌發(fā)射出520nm波長的綠色熒光。與現(xiàn)有技術(shù)相比，

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過加入5-羧基熒光素和真菌引物ITS4，在游離的狀態(tài)下真菌引物ITS4形 成莖環(huán)結(jié)構(gòu)可有效避免熒光衰退，在氫氧化鉀溶液中5-羧基熒光素可穿透真菌細(xì)胞壁及細(xì) 胞膜與真菌核糖體核糖核酸(rRNA)基因間隔(ITS)區(qū)堿基發(fā)生特異性的結(jié)合，此時(shí)莖環(huán)結(jié) 構(gòu)打開在熒光顯微鏡下鏡檢呈現(xiàn)熒光；氫氧化鉀在染色過程中熔化真菌角質(zhì)層使真菌引物 ITS4快速進(jìn)入真菌細(xì)胞內(nèi)作用；另外，由于配方中加入了抗熒光衰退劑(甘油、雙磷脂酰甘油、抗壞血酸)，使熒光引物與真菌核糖體核糖核酸(rRNA)基因間隔(ITS)區(qū)堿基特異性結(jié) 合后能長期保持，同時(shí)也增加了目標(biāo)真菌在鏡檢時(shí)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，使目標(biāo)真菌標(biāo)本與背 景之間的對比度大大增強(qiáng)，在鏡檢過程中使目標(biāo)真菌更加顯目。

因此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使用操作簡便、觀察清晰度高、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確，有較好的臨床應(yīng)用前景；在臨床檢驗(yàn)過程 中操作簡便、效率高、使用范圍全面、特異性好、準(zhǔn)確度高；檢驗(yàn)靈敏度高，減少檢驗(yàn)結(jié)果假陰性的發(fā)生，進(jìn)而降低漏檢率；視野清晰，反應(yīng)為熒光反應(yīng)，在檢驗(yàn)視野中以清晰的熒光呈現(xiàn)，便于觀察查找，大大提高工作效率；抗干擾能 力強(qiáng)，反應(yīng)為特異性結(jié)合，雜質(zhì)和非真菌細(xì)胞不會(huì)被熒光標(biāo)記，消除了雜質(zhì)和非真菌細(xì)胞對 檢驗(yàn)過程中的干擾，使目標(biāo)更加顯目易觀察；熒光保持時(shí)間長，加入了抗熒光衰減劑形成保護(hù)層對5-羧基熒光素進(jìn)行封閉式包裹，使熒光染料不與外界接觸，從而很好的保護(hù)了熒光 染料，使熒光持久不衰減，使標(biāo)本可以保存至相關(guān)規(guī)定保存期限。圖1為實(shí)施例1制得的真菌熒光染色液染色結(jié)果圖。

主要參考資料

[1] CN201710899393.8 一種真菌熒光染色液及其制備方法