背景及概述[1]
精氨酸是一種可以在體內(nèi)自然產(chǎn)生的必需氨基酸。在生命科學(xué)研究中，為了避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生，必須對(duì)精氨酸的氨基和胍基進(jìn)行保護(hù)。Fmoc-Pbf-精氨酸就是利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)氨基，用Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)保護(hù)胍基得到的氨基酸衍生物。
制備[1-2]
報(bào)道一、
(1)酯化
a1.將100L無(wú)水乙醇加入預(yù)先干燥的300L反應(yīng)釜內(nèi)，通冰鹽水降溫至-5～-10℃，滴加二氯亞砜13L。
b1.加入D型的Arg.HCl21.5kg，關(guān)閉冰鹽水，自然升溫至室溫反應(yīng)24小時(shí)。
c1.升溫至35℃反應(yīng)，TLC點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況，反應(yīng)大約48h結(jié)束。
d1.濃縮：反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮得到油狀物的Arg·Oet·2HCl中間體。
(2)引入Boc基團(tuán)
a2.在300L反應(yīng)釜內(nèi)加入150L水，再加入碳酸氫鈉25.2kg，攪拌；
逐漸加入Arg·Oet·2HCl油狀物；加入四氫呋喃30L；分批加入(Boc)2O，26.2kg攪拌，室溫反應(yīng)；
TLC法點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況，當(dāng)Arg·Oet·2HCl反應(yīng)完即開(kāi)始處理。
b2.酸化：反應(yīng)完成后調(diào)節(jié)pH3-4，用石油醚/乙酸乙酯(50L:25L)，萃??；
c2.加鹽飽和，回調(diào)PH6-7，用乙酸乙酯提產(chǎn)品，用飽和食鹽水洗滌有機(jī)相。
d2.干燥：向有機(jī)相(帶產(chǎn)品的乙酸乙酯溶液中)中加入60kg的無(wú)水硫酸鈉，干燥8小時(shí)。
e2.提純濃縮：抽濾掉硫酸鈉固體，減壓蒸餾乙酸乙酯相。濃縮后得到的Boc-ArgOet.HCl油狀物。
(3)引入Pbf
a3.在300L反應(yīng)釜中加入步驟2得到的Boc-ArgOet.HCl，Pbf-Cl31.9kg，丙酮200L，碳酸鉀41.7kg，攪拌，加少量水，維持溫度40-45℃，用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待Boc-ArgOet.HCl完全反應(yīng)進(jìn)行抽濾，
b3.抽濾，除去固體不溶物，減壓蒸餾丙酮，濃縮后的得到Boc-Arg(Pbf)Oet油狀物待用。
(4)脫Boc
a4.在干燥的300L反應(yīng)釜中，加入3NHCl/乙酸乙酯溶液120L，攪拌下加入Boc-Arg(Pbf)Oet油狀物，維持溫度10-15℃，室溫?cái)嚢琛?/p>
b4.脫Boc完成后，加水洗滌，將產(chǎn)品洗至水相，加適量碳酸鈉調(diào)節(jié)水相pH7。
(5)皂化
a5.將步驟(4)所得水相加95％乙醇100L，攪拌，滴加10NNaOH水溶液調(diào)節(jié)pH11-12進(jìn)行皂化。
b5.皂化反應(yīng)結(jié)束后，用6NHCl調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至7，降溫至-10-0℃冷凍結(jié)晶；離心，固體用乙酸乙酯攪洗一次，離心甩干收集固體；重結(jié)晶得到H-Arg(Pbf)OH固體。
(6)Fmoc-Pbf-精氨酸合成
a6.在反應(yīng)釜中加入H-Arg(Pbf)-OH，水120L、THF，用Na2CO3調(diào)節(jié)PH＝8.5。
b6.逐漸加入Fmoc-Osu(芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺)，控制溫度15-20℃，PH＝8-9以把Arg(Pbf)反應(yīng)完，盡量避免Fmoc-Osu過(guò)量。
TLC點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況，從加完Fmoc-Osu開(kāi)始計(jì)算，反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)。
c6.純化：用石油醚/乙酸乙酯(2:1)萃?。凰嘤肏Cl酸化至pH＝3，攪拌2小時(shí)。酸化溫度0-10℃；加乙酸乙酯萃取產(chǎn)品；用飽和食鹽水洗至pH達(dá)到6；無(wú)水硫酸鈉干燥，真空抽濾除去固體，濾液濃縮，減壓濃縮得到固體，真空干燥得到產(chǎn)品。
產(chǎn)品純度99.6％，單雜0.09％，L型異構(gòu)體0.15％。
報(bào)道二、
將20gL?精氨酸的單鹽酸鹽及30g水和二氧六環(huán)的混合液中(水∶二氧六環(huán)＝1∶1)加入250mL配有機(jī)械攪拌的三口燒瓶中，然后將26.5g(Boc)2O加入混合液中，攪拌下不斷滴加4N氫氧化鈉溶液，控制PH＝9?10，直至溶液變橙清且PH值保持不變，再反應(yīng)2～3小時(shí)。減壓蒸去二氧六環(huán)(水浴50℃)至干，加入17mL水稀釋后，在冰浴下用冷3N鹽酸調(diào)PH＝4～5，無(wú)水乙醚萃取(2×25mL)除雜。水相繼續(xù)用3N鹽酸調(diào)PH＝2～3，冷卻結(jié)晶，得白色固體，即Nα?叔丁氧羰基?L?精氨酸.鹽酸鹽26.2g，收率88.50％。
取20gNα?叔丁氧羰基?L?精氨酸.鹽酸鹽及140mL二氧六環(huán)加入500mL配有機(jī)械攪拌的三口燒瓶中，放置在冰浴條件下(?5～0℃)，啟動(dòng)攪拌混合均勻。攪拌條件下，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的PH＝10～12。將34.5gPbf?Cl及140mL的二氧六環(huán)加入250mL配有機(jī)械攪拌的三口燒瓶中，攪拌至完全溶解。在冰浴條件下將配制好的Pbf?Cl?二氧六環(huán)溶液滴加到Nα?叔丁氧羰基?L?精氨酸.鹽酸鹽二氧六環(huán)混合液中，滴加過(guò)程中用20％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的PH＝10～12。滴加完畢升至室溫反應(yīng)3.5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束減壓除去二氧六環(huán)，冷卻到室溫，用飽和檸檬酸水溶液調(diào)PH＝3～4，得黃色油狀物。黃色油狀物加乙酸乙脂萃取(5次×150mL)，靜置分層得到有機(jī)相和水相，合并有機(jī)相，用水和飽和鹽水交替洗滌，直至溶液PH＝5～6，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。干燥后用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀在真空條件下濃縮至干，加入200mL石油醚，充分?jǐn)嚢瑁^(guò)濾，減壓烘干得28.38gNα?叔丁氧羰基?NG?(2，2，4，6，7?五甲基苯并二氫呋喃?5?磺?；?L?精氨酸，薄層層析為一個(gè)斑點(diǎn)，收率為83.67％。
在配有機(jī)械攪拌的500mL三口燒瓶中加入130g飽和氯化氫乙醇，冷卻至?5～0℃，將25gNα?Boc?Arg(pbf)?OH加入，冰浴條件下反應(yīng)10小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH＝3～4，靜置分層得有機(jī)相和水相，有機(jī)相用水洗滌(4×120mL)，合并水相，然后用10％氫氧化鈉繼續(xù)調(diào)節(jié)PH＝7～8，冷卻到0～10℃，結(jié)晶、過(guò)濾得18.78gNG?(2，2，4，6，7?五甲基苯并二氫呋喃?5?磺?；??L?精氨酸，即NG?Arg(pbf)?OH，熔點(diǎn)為154～157℃，薄層層析為一個(gè)斑點(diǎn)，收率為92.86％。
在配有機(jī)械攪拌的500mL三口燒瓶中加入18gArg(pbf)?OH，再加入10％碳酸鈉溶液30g及二氧六環(huán)32g，然后冷卻到?5～0℃；邊攪拌邊加入15.3gN?(9?芴甲氧羰基氧)琥珀酰亞胺與125g二氧六環(huán)的混合液，冰浴下反應(yīng)2小時(shí)，再室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，乙醚萃取除去雜質(zhì)(100mL×3次)，飽和檸檬酸調(diào)節(jié)PH＝3～4，用乙酸乙脂萃取(150mL×4次)，分出有機(jī)相和水相，合并有機(jī)相并用水和飽和鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器減壓蒸餾除去大部分溶劑，加入正己烷析出白色產(chǎn)品25.31gNG?(2，2，4，6，7?五甲基苯并二氫呋喃?5?磺?；??Nα?(9?芴甲氧羰基)?L?精氨酸，即Fmoc-Pbf-精氨酸，薄板層析顯示一個(gè)斑點(diǎn)，比旋光度[α]D25＝?5.560(c＝1DMF)，收率92.36％。
參考文獻(xiàn)
[1][中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)]CN201710305099.XFmoc-Arg（Pbf）-OH的合成方法【公開(kāi)】/Fmoc-Arg（Pbf）-OH的合成方法【授權(quán)】
[2][中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)]CN200810034390.9精氨酸雙保護(hù)制備工藝